[發明專利]一種能表達小分子干擾RNA的DNA質粒及其構建方法無效
| 申請號： | 200810060213.8 | 申請日： | 2008-03-31 |
| 公開（公告）號： | CN101333539A | 公開（公告）日： | 2008-12-31 |
| 發明（設計）人： | 龔朝輝;樂燕萍;龍香娥 | 申請（專利權）人： | 寧波大學 |
| 主分類號： | C12N15/63 | 分類號： | C12N15/63;C12N15/11;C12N15/54 |
| 代理公司： | 寧波奧圣專利代理事務所（普通合伙） | 代理人： | 程曉明 |
| 地址： | 315211浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 表達 分子 干擾 rna dna 質粒 及其 構建 方法 | ||
1、一種能表達小分子干擾RNA的DNA質粒，其特征在于以載體pBlueScript/U6為骨架，在所述載體pBlueScript/U6的Apa?I和EcoR?I的酶切位點上，插入同源酶切位點的長度為21nt的DNA靶序列構建而成。
2、如權利要求1所述的一種能表達小分子干擾RNA的DNA質粒，其特征在于所述載體pBlueScript/U6為在pBlueScript的Kpn?I和Apa?I的酶切位點上，插入同源酶切位點的U6啟動子構建而成。
3、如權利要求1所述的一種能表達小分子干擾RNA的DNA質粒，其特征在于所述DNA靶序列為報告基因的編碼區的第101～121位片段。
4、如權利要求1所述的一種能表達小分子干擾RNA的DNA質粒，其特征在于所述DNA靶序列為腫瘤細胞內源基因周期蛋白依賴性激酶2基因的編碼區的第66～86位片段。
5、如權利要求1所述的一種能表達小分子干擾RNA的DNA質粒，其特征在于所述DNA靶序列為DNA甲基轉移酶1基因的編碼區的第85～105位片段。
6、一種權利要求1所述的能表達小分子干擾RNA的DNA質粒的構建方法，其特征在于包括下述步驟：
1)以pmU6質粒為模板，通過PCR擴增反應獲得在左側含有Kpn?I酶切位點和在右側含有Apa?I酶切位點的U6啟動子序列；
2)將上述U6啟動子序列插入到同樣含有Kpn?I和Apa?I的酶切位點的pBlueScript上，然后轉入感受態細胞E.coli?TGl中，經過篩選、擴增和抽提獲得載體pBlueScript/U6；
3)應用siRNA?target?finder軟件分析篩選出含有Apa?I和EcoR?I的酶切位點的長度為21nt的DNA靶序列，體外人工合成該DNA靶序列；
4)將上述DNA靶序列插入到所述載體pBlueScript/U6的Apa?I和EcoR?I的酶切位點上，利用質粒抽提試劑盒抽提得到能表達小分子干擾RNA的DNA質粒。
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