[發(fā)明專利]新型單純皰疹病毒Ⅱ型DNA疫苗

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810060185.X
• 申請日: 2008-03-14
• 公開（公告）號: CN101288770A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪艷;陳勇;何方;楊連華
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;C12N15/79;C12N15/38;C12N15/11;A61P31/22
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 韓介梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于預(yù)防和治療單純皰疹病毒II型感染疾病的新型單純皰疹病毒II型DNA疫苗。

背景技術(shù)

單純皰疹病毒(HSV)分為I型(HSV-1)和II型(HSV-2)兩個血清型，臨床上主要表現(xiàn)為皮膚粘膜的皰疹，如唇皰疹和生殖器皰疹、或皰疹性腦炎。無論是發(fā)展中國家還是發(fā)達(dá)國家，HSV自然感染率都相當(dāng)高。全世界總?cè)丝谥校s70％的人血清HSV抗體陽性，超過三分之一的人有復(fù)發(fā)性HSV感染，是個亟待解決的問題。

研制有效疫苗是控制HSV感染的關(guān)鍵。由于HSV能形成潛伏感染和具有致癌潛能，幾乎排除了采用傳統(tǒng)滅活或減毒法制備HSV疫苗的可能性，因此多肽疫苗和DNA疫苗的研制成為主要熱點(diǎn)。其中DNA疫苗由于具有多肽疫苗的安全性和減毒活疫苗誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答的高效性，備受青睞。

DNA疫苗的研究始于1990年Wollf等的發(fā)現(xiàn)。作為一種新型疫苗，DNA疫苗具有諸多傳統(tǒng)疫苗沒有的優(yōu)越性，它能激發(fā)機(jī)體同時產(chǎn)生持久的體液和細(xì)胞免疫，制備簡單且純度很高，進(jìn)入體內(nèi)后既不插入染色體DNA也不復(fù)制，因而比較安全。已有人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、輪狀病毒及瘧疾等的DNA疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、病毒及無脊椎動物的DNA中含有一些具有免疫學(xué)活性的短核苷酸序列，這些短核苷酸序列大多含有非甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核

苷酸(CpG)為基元的特定結(jié)構(gòu)，即CpG基序(CpG?motif)或免疫刺激序列(Immunostimulatory?sequences，ISS)或CpG?DNA，而將含有CpG序列的寡核苷酸(Oligonucleotide，ODN)稱為CpG?ODN。大量研究表明，CpG?ODN可激活小鼠或人的N?K細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞增殖，活化并產(chǎn)生免疫球蛋白，誘導(dǎo)分泌IL26、IL212、TNF2α、IFN2γ等多種細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)非特異性免疫應(yīng)答、增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答及調(diào)控免疫應(yīng)答類型(Th1或Th2型)方面發(fā)揮了重要作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的提供具有預(yù)防和治療作用的單純皰疹病毒II型DNA疫苗。

本發(fā)明涉及一種單純皰疹病毒II型DNA疫苗，它包括含全長的糖蛋白D基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pgD和含CpG基序的真核表達(dá)質(zhì)粒pCpG。

真核表達(dá)質(zhì)粒pgD由真核表達(dá)載體pKan和插入其中的單純皰疹病毒II型糖蛋白D基因組成。真核表達(dá)載體pKan為pcDNA3中的Amp⁺基因片斷被Kan基因片段所取代后構(gòu)建的載體。真核表達(dá)載體pCpG由真核表達(dá)載體pKan和插入其中的3-10個CpG基序組成。全長的糖蛋白D基因來源于單純皰疹病毒II型毒株。

本發(fā)明首先構(gòu)建了具有卡那霉素抗性基因的真核表達(dá)載體。本發(fā)明設(shè)計(jì)的載體具有以下幾個特點(diǎn)：(1)采用卡那霉素抗性基因，避免使用氨卞青霉素抗性基因帶來的對過敏人群的潛在危害性；(2)含有質(zhì)粒復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)和真核表達(dá)調(diào)控必需元件(包括啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號)。本發(fā)明設(shè)計(jì)一對引物從質(zhì)粒pET-28a(+)上通過PCR擴(kuò)增獲取kan⁺基因片斷，設(shè)計(jì)第二對引物從質(zhì)粒pcDNA3上通過高保真PCR獲取除Amp⁺基因片斷以外的全部質(zhì)粒片斷。將得到的兩個PCR產(chǎn)物連接重組獲得新型真核表達(dá)質(zhì)粒載體pkan。

本發(fā)明插入的外源基因來源于單純皰疹病毒II型sav株糖蛋白D基因，其結(jié)構(gòu)描述如下所示：

(1)序列特征

長度：1314bp

類型：核酸

鏈數(shù)：雙鏈

幾何結(jié)構(gòu)：線性

(2)分子類型：DNA

(3)來源：單純皰疹病毒II型sav株，購自中國科學(xué)院病毒聽。

(4)序列描述：如序列表所示。

本發(fā)明合成了含有3-10個CpG基序的片斷，通過多克隆位點(diǎn)插入到自己構(gòu)建的新型真核表達(dá)載體pkan中，獲得pCpG。

本發(fā)明從單純皰疹病毒II型sav株糖蛋白D基因中獲取全長的gD基因克隆自己構(gòu)建的新型真核表達(dá)載體pkan中，獲得pgD；由真核表達(dá)載體pkan和插入其中的3-10個CpG基序獲得pCpG；按不同比例混合組成DNA疫苗。該疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫，預(yù)防和治療單純皰疹病毒II型感染，解決單純皰疹病毒II型感染反復(fù)復(fù)發(fā)的嚴(yán)重問題。