[發(fā)明專利]抗人Reg4的單克隆抗體及其制備與應(yīng)用以及雜交瘤細(xì)胞株

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810060115.4
• 申請(qǐng)日: 2008-03-07
• 公開（公告）號(hào): CN101270161A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 來茂德;李風(fēng)英;沈建根
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C12N5/18;G01N33/577
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗人再生基因4(Regenrating?gene?4，簡(jiǎn)稱Reg4)的單克隆抗體及其制備與應(yīng)用，以及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

(二)背景技術(shù)

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一。早期診斷、早期治療已被公認(rèn)為改善結(jié)直腸癌療效和預(yù)后的關(guān)鍵，其意義遠(yuǎn)大于任何一種治療方案。絕大部分結(jié)直腸腺癌是由腺瘤癌變而來，如能及時(shí)發(fā)現(xiàn)并切除腺瘤，很可能會(huì)將發(fā)病率不斷攀升的結(jié)直腸癌防范于未然，或使其治愈率得到根本的改觀。但目前常用的結(jié)直腸腫瘤標(biāo)志物，如CEA、TP53、K-RAS、CD95等，均存在特異性和靈敏度不能兼顧的問題，尤其在結(jié)直腸腺瘤和早期癌癥患者中更是如此。為了尋找更理想，與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的新的腫瘤標(biāo)志物，為協(xié)助結(jié)直腸癌的臨床診斷，監(jiān)視病情發(fā)展及判斷預(yù)后提供新的手段，同時(shí)加深對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，本實(shí)驗(yàn)室自1999年起利用抑制性差減雜交的方法來篩選結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的相關(guān)基因，并利用同一病人的正常粘膜，腺瘤和腺癌建立了三個(gè)差減文庫(kù)，即腺瘤相對(duì)于正常粘膜的差異片斷文庫(kù)(A-N)，腺癌相對(duì)于正常粘膜的差異片斷文庫(kù)(T-N)和腺癌相對(duì)于腺瘤的差異片斷文庫(kù)(T-A)。其中在A-N文庫(kù)中篩選出一個(gè)未知基因，通過表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)組裝，BLAST搜索，發(fā)現(xiàn)該基因即2001年從炎癥性腸病文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的Reg4基因。在此基礎(chǔ)上做了很多工作，積累了不少資料。其中RT-PCR，Northern?blot和原位雜交的結(jié)果均顯示Reg4在結(jié)直腸腺瘤和腺癌中的表達(dá)較配對(duì)的正常粘膜高，且在腺瘤癌變時(shí)表達(dá)最高，提示Reg4可能是腺瘤癌變的預(yù)警指標(biāo)，是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期分子標(biāo)志。

Reg家族屬于鈣依賴的植物血凝素超家族，它代表一組分泌蛋白，主要作為急性期反應(yīng)蛋白、促進(jìn)生長(zhǎng)、抗凋亡因子參與到損傷，炎癥，糖尿病以及腫瘤發(fā)生過程中。Reg4是該家族的新成員，人們對(duì)其了解不很詳盡。由于Reg4在Crohn病和潰瘍性結(jié)腸炎中高表達(dá)，因此hartupee認(rèn)為Reg4可能具有絲裂原和生長(zhǎng)因子的作用。近年來隨著研究的深入，Reg4在腫瘤尤其是消化道腫瘤中的作用日漸被重視。最近來自日本實(shí)驗(yàn)室的一篇文章報(bào)道Reg4在胰腺導(dǎo)管腺癌中高表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)Reg4具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。同時(shí)也有研究表明Reg4在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)。華盛頓大學(xué)一實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)Reg4可能是EGF受體/AKT/AP-1信號(hào)通路的激活物。但是作為一種新發(fā)現(xiàn)的基因，對(duì)Reg4的功能知之甚少，因此有必要對(duì)Reg4進(jìn)行深入的研究。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種抗人再生基因4的單克隆抗體及其制備與應(yīng)用，以及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種抗人再生基因4的單克隆抗體，所述單克隆抗體對(duì)SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸(即SEQ?ID?No.3所示核苷酸序列)編碼的多肽具有特異性。所述單克隆抗體由保藏編號(hào)為CCTCC?No：C200728的細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。本發(fā)明關(guān)鍵在于免疫抗原的確定，選擇SEQID?No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸編碼的多肽作為抗原，在已知抗原前提下，抗體可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)方便的獲得。

所述單克隆抗體對(duì)Reg4-his融合蛋白(分子量為17KD)具有反應(yīng)性，所述Reg4-his融合蛋白氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

所述單克隆抗體為IgG1亞型，命名為Reg4-G7。

一種產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期2007年10月1日，保藏編號(hào)CCTCC?No：C200728。所述雜交瘤細(xì)胞株由免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞經(jīng)融合、篩選、克隆、傳代和反復(fù)凍存、復(fù)蘇后獲得的小鼠雜交瘤細(xì)胞系Reg4-G7，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體Reg4-G7。

一種所述單克隆抗體的制備方法，所述方法包括：用SEQ?ID?No.2所示Reg4-his融合蛋白免疫小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出能夠分泌對(duì)SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸編碼的多肽具有特異性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞上清液中或從注射雜交瘤細(xì)胞的動(dòng)物腹水中，獲得所述單克隆抗體。