[發明專利]維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法

有效

• 申請號: 200810059758.7
• 申請日: 2008-02-25
• 公開（公告）號: CN101245337A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 何超;廖永強;朱洪波
• 申請（專利權）人: 浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所
• 代理人: 吳秉中

????????????????????????技術領域

本發明屬于大腸癌腫瘤細胞原代培養技術領域。

????????????????????????背景技術

迄今為止，國內外在從大腸癌組織中分離、純化腫瘤細胞并建立穩定生長的大腸癌腫瘤細胞均沒有獲得高效的方法。雖然通過大量標本的篩選最終可以建立起細胞系，但巨大的工作量及漫長的篩選時間使其培養效率相當低下。由于原代腫瘤可以很好地保持原始狀態的腫瘤生物學特性，對于腫瘤本身研究及各種抗腫瘤藥物研究均具有重要意義，尋求一種簡便而又高效的原代培養方法非常迫切，并且很多建立在大腸癌細胞系水平的研究也需要在原代細胞水平進一步驗證其可靠性。大量資料表明，原代大腸癌培養的難點在于：細菌及成纖維細胞污染，初代細胞生長困難，繼代生長緩慢或停滯。而最大的難點在于影響細胞長期生長的繼代生長停滯。因很多實驗無需長久代次的腫瘤生長，故本研究主要致力于短期存活的大腸癌原代細胞的培養和純化，可供原代腫瘤的蛋白、DNA、RNA提取，部分免疫學檢測等研究。

????????????????????????發明內容

本發明目的在于克服現有技術中存在的一些問題，提供一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法的技術方案。

一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

1)手術獲取新鮮狀態腫瘤標本，生理鹽水清洗并剪去污穢及壞死區域后，碘伏浸泡消毒5分鐘，采用含雙抗的PBS清洗液清洗；

2)在含雙抗的PBS清洗液中將上述腫瘤標本剪成細小組織塊，靜置、去上清液，之后再用含雙抗的PBS清洗液清洗，離心分離，去上清液；

3)采用膠原酶消化法或組織塊貼壁法，在培養液中進行組織貼壁及細胞爬出，所述的培養液為10-20％胎牛血清培養液；

4)在上述培養液中繼續培養并純化處理，維持細胞生長至所需數量。

所述的一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法，其特征在于所述的膠原酶消化法工藝步驟為：

1)根據標本組織塊量，按1∶8-12的體積比加入膠原酶消化液，置于37℃水浴搖箱中作用0.5-3小時，至組織塊均呈半毛絮狀或細小顆粒狀，靜置，滴管吸棄上清液；

2)離心分離，用滴管吸棄上清液，然后使用無血清DMEM培養液重懸、吹洗混勻，離心，棄上清液；

3)在10-20％胎牛血清培養液中以薄量液體培養方式培養48小時后，棄去原培養液，換入足量新培養液，并每3日換一次培養液；

所述的一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法，其特征在于所述的組織塊貼壁法工藝步驟為：

1)經處理后的標本組織加入無血清DMEM培養液重懸、清洗，離心分離，棄上清液；

2)根據標本組織塊量，按1∶8-12的體積比加入膠原酶消化液，置于37℃水浴搖箱中作用20-40分鐘，使組織塊表面間質分離，暴露腫瘤細胞，之后用無血清DEME培養液清洗，靜置沉淀、棄上清液；

3)加入純胎牛血清(FBS)，混勻，使標本組織充分浸潤；

4)組織塊的種植：將純胎牛血清(FBS)浸泡的組織塊吸至培養瓶或培養皿內，分布均勻，繼續滴加純胎牛血清(FBS)至完全覆蓋培養瓶或培養皿底面，將培養瓶或培養皿緩慢傾斜狀態放置入培養箱內，使組織塊黏附貼壁；

5)6-12小時后，加入10-20％胎牛血清培養液，使組織塊剛好被浸沒而不至于浮起，重新水平位放入培養箱內培養，根據組織塊的多少每隔24-48小時換一次培養液。至組織塊貼壁牢固后，加入足量培養液每72小時換液一次。

所述的一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法，其特征在于所述的純化處理采用機械刮除法，其工藝步驟為：

1)標記：顯微鏡下觀察，用標記筆在培養瓶或培養皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；

2)刮除：棄掉培養液，于超凈臺內把無菌膠刮或棉簽伸入瓶皿中，肉眼觀察下，刮除無標記空間；

3)用PBS清洗液清洗，洗除被刮掉的細胞；

4)注入培養液繼續培養，如發現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止。

所述的一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法，其特征在于所述的純化處理采用消化排除法，其工藝步驟為：

1)首先用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合消化液漂洗培養細胞，使之浸沒細胞，然后棄去消化液，使細胞處于薄層消化液消化狀態，在倒置顯微鏡下定時觀察并不時搖動培養瓶；