[發明專利]改良Cry3的方法、改良Cry3、質粒及其應用

有效

• 申請號: 200810059372.6
• 申請日: 2008-01-24
• 公開（公告）號: CN101492490A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 沈志成;方軍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K1/107
• 分類號: C07K1/107;C07K14/325;C12N15/32;C12N15/63;A01H1/00
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種增強蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質Cry3對玉米根蟲(Diabrotica?virgifera?virgifera)的殺蟲能力的方法，以及利用這種方法獲得的改良Cry3、所用質粒，及其在制備轉基因抗蟲玉米中的應用。?

(二)背景技術

玉米根蟲是一種最具有破壞性的玉米害蟲。在美國，3種重要種分別為：西方玉米根蟲(D.virgifera?virgifera)、北方玉米根蟲(D.undecimpunctatahowardi)和南方玉米根蟲(D.undecimpunctata?howardi)。西方玉米根蟲和北方玉米根蟲是美國玉米栽培中的首要害蟲。玉米根蟲通過取食植物根部引起植物嚴重損傷。這種損傷表現在增加玉米倒伏，減少玉米產量和生物量而改變植物的營養含量。玉米根蟲的取食還間接影響植物病原生物的侵入，幼蟲對根的損傷，使植物病原細菌、真菌等微生物可以更容易侵入到植物中。玉米根蟲成蟲在夏末玉米田中非常活躍，它們取食葉耳，葉絲和花粉，干擾了玉米的正常授粉。?

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis)最早于1902年在日本國發現，1911年在德國再次被發現并得鑒定，是一種格蘭氏陽性細菌。在它的孢子形成過程中，合成出大量的殺蟲結晶包涵體(insecticidal?crystallineinclusions)，其中的晶體蛋白質(crystalline?protein，Cry)是由叫做σ-內毒素(σ-endotoxins)的原毒素亞基(protoxin?subunit)組成的。大多數的蘇云金芽孢桿菌菌株都會產生一系列的σ-內毒素，它對許多昆蟲都具有特異的毒性，故這種蛋白質又叫做殺蟲晶體蛋白(insecticidal?crystal?protein，ICP)，?或蘇云會芽孢桿菌毒蛋白(Bt?toxin)。此外，蘇云金芽孢桿菌在生長及芽孢形成期間，還能分泌一些外毒素，叫做蘇云金毒素或β-外毒素(β-exotoxin)，同樣也具有抑制幼蟲生長的能力?

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，Bt)δ-內毒素Cry3有殺甲蟲的活性。Cry3A蛋白對科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa?decemlineata)有很好的殺蟲活性，但對Diabrotica屬的甲蟲沒有殺蟲活性(Johnson?et?al.，1993，J.Econ.Entomol.86：330?333)。根據Slaney等所述(1992，InsectBiochem.Molec.Biol.22：918)，Cry3A蛋白對科羅拉多馬鈴薯甲蟲的殺蟲活性是南方玉米根蟲(D.undecimpunctata?howardi)的2000倍。而且，Cry3A蛋白對西方玉米根蟲有很小的或者沒有殺蟲活性。同樣，Cry3B對西方玉米根蟲有比較低的殺蟲能力，但是殺蟲活性仍然不夠理想。?

由于δ-內毒素殺蟲機理的了解，改造δ-內毒素使其更有殺蟲活性成為了可能。Li等人1991年確定Cry3A的三維結構時，改造δ-內毒素更成就為一種可能。Cry3A蛋白具有3個結構域：N-端的1-290個氨基酸是第一個結構域，由7個α螺旋組成；第二個結構域從291-500個氨基酸，包含3個β折疊；C-端的501-644個氨基酸是第三個結構域，是一個β-折疊。基于這種結構，提出了一個關于δ-內毒素結構和功能關系的一個假說。這個假說一般來說是結構域I是在昆蟲腸膜形成穿孔的主要因素(Gazit?and?Shai，1993，Appl.Environ.Microbiol.57：2816?2820)，結構域II是和腸膜受體結合的主要部分(Gazit?and?Shai，1993，Appl.Environ.Microbiol.57：2816?2820)，而結構域III有調節離子通道活性的功能(Chen?et?al.，1993，PNAS?90：90419045)，最有可能和蛋白的穩定性有關(Li?et?al.1991，supra)。?