[發(fā)明專利]一種洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810059304.X
• 申請日: 2008-01-16
• 公開（公告）號: CN101215551A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳劍平;徐剛;汪一婷;呂永平;牟豪杰;鄭紅英;林林;程曄
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 陳繼亮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物脫毒組培快繁技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法。

背景技術(shù)

洋水仙(Narcisses)是從歐洲引入我國的水仙新品種的統(tǒng)稱，為石蒜科水仙屬多年生草本植物。20世紀(jì)80年代后進行較大規(guī)模的引入，主要用于春季花展，少量盆栽作為年宵花使用。洋水仙與中國水仙相比，具有花大色艷，清香宜人等特點；大部分品種副花冠成喇叭狀，且以黃色為多，因而又泛稱為“喇叭水仙”或“黃水仙”。洋水仙是優(yōu)良的園林地被花卉，可以盆栽觀賞和切花使用。洋水仙一般通過分蘗的子球進行繁殖，每個母鱗莖可分蘗2～4個小鱗莖。但是，由于病毒侵染導(dǎo)致逐年退化，鱗莖變小，開花能力下降。

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從英國引進洋水仙新品種，擬通過脫毒組培技術(shù)大量繁殖脫毒鱗莖，以滿足國內(nèi)市場需要，同時克服病毒的危害和蔓延。我們在從英國引進栽培于溫室的洋水仙中發(fā)現(xiàn)，絕大部分植株均表現(xiàn)花葉和斑駁等癥狀。通過對病毒病原的普通生物學(xué)、血清學(xué)特征和基因組全序列的研究，鑒定了侵染水仙的主要線狀病毒有4個屬的8個成員，包括馬鈴薯Y病毒屬(genus?Potyvirus)水仙黃條病毒(Narcissus?yellow?stripe?virus，NYSV)，水仙遲季黃化病毒(Narcissus?late?season?yellows?virus，NLSYV)，水仙退化病毒(Narcissus?degenerationvirus，NDV)，虎眼萬年青花葉病毒(Ornithogalum?mosaic?virus，OrMV)，香石竹潛隱病毒屬(genus?Carlavirus)水仙普通潛隱病毒(Narcissus?common?latent?virus，NCLV)，水仙無癥病毒(Narcissus?symptomless?virus，NSV)，柘橙病毒屬(genus?Macluravirus)水仙潛隱病毒(Narcissus?latent?virus，NLV)，馬鈴薯X病毒屬(genus?Potexvirus)水仙花葉病毒(Narcissus?mosaicvirus，NMV)等8種病毒。這8種病毒單獨或復(fù)合侵染是引起洋水仙種質(zhì)嚴(yán)重退化的重要原因之一。

植物病毒的毒源保存特別是純種毒源保存是抗病毒育種和病毒檢測中制備抗血清及病毒的基礎(chǔ)研究必備的材料。傳統(tǒng)保存是在溫室內(nèi)將病毒接種到指示植物或寄主植物上定期轉(zhuǎn)接進行保存，工作量大且效果不理想。由于多種病毒毒源植物在裸露的條件下保存在同一溫室內(nèi)，易造成混雜；同時需一定的溫室面積，適宜的溫、濕條件，尤其寒區(qū)冬季的取暖，耗費人力、財力大；另外毒源植物在棚室內(nèi)，易感染雜菌死亡，導(dǎo)致病毒丟失；同時此法保存的毒源亦不便攜帶和利用。因此，迫切需要選擇一種更佳的保存方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法。

本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：這種洋水仙病毒的組培鱗莖保存方法，按如下步驟進行：

1)、洋水仙病毒病原種類的鑒定

(1)取病樣：取洋水仙花葉病害病樣，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

(2)電鏡觀察：取病汁液經(jīng)負(fù)染后，用電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)。

(3)病毒的提純：利用差速離心和蔗糖階梯式密度離心的分離法，對感染葉片的有關(guān)病毒進行分離、純化。

(4)病毒種類的鑒定：利用RT-PCR檢測和鑒定洋水仙的病毒種類。

2)、培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為：

(1)基本培養(yǎng)基：選用MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖20～40g/L，瓊脂7～9?g/L，pH5.6～5.8；

(2)子鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+BA?0.1～1mg/L和NAA?0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；

(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基：MS+BA?0.05～0.5mg/L和NAA?0.1～1mg/L+蔗糖或白糖40g/L；

(4)子鱗莖保存培養(yǎng)基：1/2MS+BA?0.01～0.1mg/L和NAA?0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L；

(5)鱗莖生長培養(yǎng)基：MS+BA?0.01～0.1mg/L和NAA?0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖40g/L；

(6)生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA?0.1～0.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L。

3)、洋水仙脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)，按如下步驟進行：

(1)鱗莖低溫處理：鱗莖經(jīng)8℃低溫處理2～4周。