[發(fā)明專利]一種浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810059303.5
• 申請(qǐng)日: 2008-01-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101215550A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳劍平;徐剛;汪一婷;呂永平;牟豪杰;鄭紅英;林林;程曄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 陳繼亮

1.一種浙貝母病毒的組培鱗莖保存方法，其特征在于：該方法按以下步驟進(jìn)行：

1)、浙貝母病毒病原種類的鑒定：

2)、培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為：

(1)基本培養(yǎng)基：選用MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖20～40g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～5.8；

(2)子鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2，4-D?0.5～1.5mg/L和ZT?1～3mg/L+蔗糖或白糖30g/L；

(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基：MS+BA?1～3mg/L和NAA?1～3mg/L+蔗糖或白糖40g/L+鹽酸硫胺素(VB₁)4mg/L；

(4)壯苗培養(yǎng)基：MS+BA?0.5～1.5mg/L和NAA?0.5～1.5mg/L+蔗糖或白糖40g/L+鹽酸硫胺素(VB₁)4mg/L；

(5)子鱗莖保存培養(yǎng)基：1/2MS+BA?0.05～0.1mg/L和NAA?0.05～0.1mg/L+蔗糖或白糖20g/L+鹽酸硫胺素(VB₁)4mg/L；

(6)鱗莖生長(zhǎng)培養(yǎng)基：MS+BA?0.1～1mg/L和NAA?0.1～1mg/L+蔗糖或白糖40g/L+鹽酸硫胺素(VB₁)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L；

(7)生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA?0.1～1mg/L+蔗糖或白糖20g/L+鹽酸硫胺素(VB₁)4mg/L；

3)、浙貝母脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)，按如下步驟進(jìn)行：

(1)外植體的選取與滅菌：取浙貝母新生長(zhǎng)的鱗莖或嫩莖或花梗為外植體，經(jīng)滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；

(2)子鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟(1)滅菌處理后的鱗莖或嫩莖或花梗在無(wú)菌條件下，切成0.3～0.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)1～2個(gè)月后，從鱗莖或嫩莖或花梗外植體上誘導(dǎo)形成子鱗莖；

(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)形成的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天增殖出子鱗莖；

(4)壯苗培養(yǎng)：將步驟(3)增殖的子鱗莖經(jīng)4℃低溫處理1周，然后培養(yǎng)30～45天后長(zhǎng)成壯苗；

(5)熱處理：將步驟(4)長(zhǎng)成的壯苗經(jīng)35℃、2～4周處理后，供莖尖培養(yǎng)用；

(6)莖尖培養(yǎng)：將步驟(5)熱處理過(guò)的組培苗在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0.2～0.5mm大小的帶1～2個(gè)葉原基的莖尖作為脫毒培養(yǎng)的外植體；

(7)子鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟(6)摘出的莖尖接種在子鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)1～2個(gè)月后，誘導(dǎo)形成子鱗莖；

(8)子鱗莖增殖培養(yǎng)：將步驟(7)誘導(dǎo)形成的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天增殖出子鱗莖；每隔30～45天，將步驟10)增殖的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天再增殖出子鱗莖；

(9)子鱗莖生長(zhǎng)培養(yǎng)：將步驟(8)增殖的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天使鱗莖長(zhǎng)大到0.5～1cm；

(10)生根培養(yǎng)：將步驟(9)長(zhǎng)大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，20～30天后，子鱗莖上部長(zhǎng)出葉片，子鱗莖基部長(zhǎng)出數(shù)根根系；

(11)移栽：當(dāng)步驟(10)的生根子鱗莖苗高生長(zhǎng)至3～5cm以上、根長(zhǎng)出5根以上時(shí)，移栽基質(zhì)培養(yǎng)1～2個(gè)月至成苗；

(12)定植：將步驟(11)的移栽苗定植在溫室內(nèi)的盆缽中，培養(yǎng)6～10個(gè)月至植株：

4)、病毒ELISA檢測(cè)：

應(yīng)用病毒外殼蛋白基因擴(kuò)增、克隆和原核表達(dá)，以獲得大量相關(guān)病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，供病毒ELISA檢測(cè)之用；

5)、病毒摩擦接種：按照裘維蕃的方法，將步驟1)分離純化的病毒通過(guò)汁液摩擦接種到步驟4)檢測(cè)為無(wú)病毒的浙貝母植株上；

6)、病毒的鱗莖保存：將步驟5)接種上病毒的浙貝母進(jìn)行組培鱗莖的培養(yǎng)和保存，按如下步驟進(jìn)行：

(1)外植體的選取與滅菌：取浙貝母新生長(zhǎng)的鱗莖或嫩莖或花梗為外植體，經(jīng)滅菌處理，作為組培用的外植體；

(2)子鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟(1)滅菌處理后的鱗莖或嫩莖或花梗在無(wú)菌條件下，切成0.3～0.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)1～2個(gè)月后，從鱗莖或嫩莖或花梗外植體上誘導(dǎo)形成子鱗莖；

(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)形成的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天增殖出子鱗莖；每隔30～45天，將增殖的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天再增殖出子鱗莖；

(4)子鱗莖保存：將步驟(3)增殖的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖保存培養(yǎng)基上，保存培養(yǎng)10～12個(gè)月，子鱗莖生長(zhǎng)緩慢，鱗莖長(zhǎng)大0.3～0.6cm；每隔10～12個(gè)月，將保存的子鱗莖轉(zhuǎn)接到新鮮的子鱗莖保存培養(yǎng)基上，繼續(xù)進(jìn)行保存培養(yǎng)；

(5)子鱗莖生長(zhǎng)培養(yǎng)：將步驟(4)保存的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天使鱗莖長(zhǎng)大到0.5～1cm；

(6)生根培養(yǎng)：將步驟(5)長(zhǎng)大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，20～30天后，子鱗莖上部長(zhǎng)出葉片，子鱗莖基部長(zhǎng)出數(shù)根根系；

(7)移栽：當(dāng)步驟(6)的生根子鱗莖苗高生長(zhǎng)至3～5cm以上、根長(zhǎng)出5根以上時(shí)，移栽基質(zhì)培養(yǎng)1～2個(gè)月至成苗；

(8)定植：將步驟(7)的移栽苗定植在溫室內(nèi)的盆缽中，培養(yǎng)6～10個(gè)月至植株。