[發明專利]一種通過花藥培養獲得馬蹄蓮單培體植株的方法

無效

• 申請號: 200810058982.4
• 申請日: 2008-09-27
• 公開（公告）號: CN101385442A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發明（設計）人: 張樂民;王世敏;鄭思鄉
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N5/04
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司
• 代理人: 楊宏珍

1.一種通過花藥培養獲得馬蹄蓮單倍體植株的方法，包括外植體消毒、愈傷組織的誘導、愈傷組織分化芽及芽生根步驟；其特征在于本發明方法的具體步驟如下：

a.供體馬蹄蓮材料的適宜生長季節為秋、冬季節，適宜生長溫度為最高氣溫25℃，最低氣溫10℃；

b.進行離體培養的花藥及小孢子的合適發育時期：花蕾微露出葉柄、花藥顏色呈乳白色、小孢子處在單核靠邊期；

c.外植體消毒：取小孢子處在單核靠邊期的馬蹄蓮花蕾，剝去苞片，在超凈工作臺中，用1％次氯酸鈉+0.05％Tween-20消毒花蕊，時間為10分鐘，然后用無菌水沖洗3次，沖洗時間分別為1分鐘，5分鐘，10分鐘；

d.愈傷組織的誘導：用解剖刀將經上述消毒的花藥從花蕊上刮下，接種在愈傷組織誘導培養基上，愈傷組織誘導培養基配方為Gamborg?B5+蔗糖80g/L+KT?1.0mg/L+2，4-D?0.5mg/L+瓊脂7g/L，培養基用母液配置，用1mol/LNaOH調pH到5.8，121℃15分鐘高壓滅菌，其中激素是過濾滅菌，在培養基分裝前加入，高壓滅菌后的培養基冷卻到40℃時在超凈工作臺內快速分裝在已高壓滅菌的60x15mm的培養皿中，每皿裝10mL愈傷組織誘導培養基，接種密度為60-70個花藥/培養皿，培養條件為32℃、暗培養2天后，轉入25℃、暗培養50天，再將其轉至上述愈傷組織誘導培養基，在25℃、黑暗條件下，進行繼代培養20天，花藥長出愈傷組織；

e.愈傷組織分化芽：將上述繼代培養20天后的愈傷組織置于芽誘導培養基，誘導生芽，芽誘導培養基配方為Murashige?and?Skoog+蔗糖30g/L+BA?1.0mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7g/L，pH5.8，培養條件：溫度25℃，光強2000Lx，光照時間16小時，培養30天后愈傷組織分化出芽；

f.芽生根：芽長到高4cm時，將芽置于生根培養基誘導生根，生根培養基配方為MS+蔗糖30g/L+IBA?0.5mg/L+瓊脂7g/L，pH到5.8，在溫度25℃，光強2000Lx，光照時間16小時的培養條件培養20天，小苗生根，形成馬蹄蓮單倍體植株。