[發明專利]滇紫草細胞的超低溫凍存方法

無效

• 申請號: 200810058876.6
• 申請日: 2008-09-04
• 公開（公告）號: CN101343620A
• 公開（公告）日: 2009-01-14
• 發明（設計）人: 葛鋒;陳朝銀;韓本勇;熊向峰
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司
• 代理人: 金耀生

技術領域

本發明涉及一種能將滇紫草細胞超低溫凍存保藏的方法。

背景技術

滇紫草(Onosmapaniculatum?Bur.et?Fr.)主產云南，是云南省本地常用中草藥，屬紫草科(Boraginaceae)植物，其根藥用。主要有效成分為紫草素及其衍生物，這些成分不但具有抗菌、抗炎、抗癌等多種藥理作用，而且還作為天然色素廣泛用于醫藥、化妝品和印染工業。目前，滇紫草的野生資源破壞嚴重，市場上供需矛盾凸顯。而利用植物細胞大規模培養技術在反應器中直接培養細胞獲得藥用次生代謝產物是將來生產植物藥最直接、最有效的手段。開展細胞培養技術，最重要的就是要篩選出一個品質好的細胞株系。細胞株經過長時間繼代培養后，品質會退化。因此，必須找到一種方法，在保證原有細胞品質的前提下，把細胞長時間保存下來。

目前，保存活細胞最有效的方法就是液氮超低保藏法。這種方法以有機溶劑作為保護劑，在液氮超低溫(-196℃)下保藏。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細胞內的自由水通過細胞膜外滲出來，以免膜內因自由水凝結成冰晶而使細胞損傷。使用液氮超低溫保藏法的關鍵問題在于：1.保護劑組分和各組分濃度的選擇；2.超低溫保藏冷凍階段和解凍復蘇階段的操作步驟。以上兩點決定著保藏的最終效果，是超低溫保藏過程的技術的重點和難點。

發明內容

本發明的目的是提供一種能有效實現滇紫草細胞超低溫凍存保藏的方法。

該方法的操作步驟如下：

1)滇紫草細胞的繼代培養：用繼代培養基，培養條件為固體培養，pH值5.6，溫度25℃，避光培養；

2)滇紫草細胞超低溫處理前的預培養：將繼代培養8-11天的細胞轉移至含5-10％二甲亞砜(DMSO)的繼代培養基上預培養4-8天；

3)脫水處理：以甘油15-30％、乙二醇10-20％、二甲亞砜5-10％、MS基礎培養基余量和蔗糖0.3-0.6mol/L為組分，配成冷凍保護劑，將細胞放入15-25℃冷凍保護劑中處理15-30min，然后在0℃預冷30min；

4)冷凍過程：將預冷好的細胞和冷凍保護劑一塊投入液氮中凍存；

5)解凍過程：從液氮中取出凍存細胞，在10-25℃水浴中進行解凍，然后用含0.5-1.0mol/L蔗糖濃度MS培養基對細胞進行洗滌，去除冷凍保護劑；

6)細胞的復蘇：解凍后，經過洗滌的細胞轉入繼代培養基中進行恢復培養。

本發明內容的關鍵點在于：1.細胞預培養過程DMSO濃度和培養時間的確定；2.脫水處理時，冷凍保護劑各組分濃度的確定以及脫水溫度和時間的選擇；3.解凍溫度選擇，以及洗滌溶液蔗糖濃度的調整。以上關鍵點如能把握好，細胞復蘇后，可以獲得滿意的細胞成活率。

本發明操作簡便，凍存效果好，采用文中所述方法對滇紫草細胞進行凍存，解凍后，細胞存活率高，復蘇的細胞可以長期繼代培養，是保存滇紫草種質資源的有效方法。

具體實施方式

下實施例用于說明本發明，但不是對本發明的限制。

實施例1：

1)滇紫草細胞的繼代培養：繼代培養基為：MS基礎培養基+NAA?1.0mg/L+2，4-D?0.2mg/L，培養條件為固體培養，pH值5.6，溫度25℃，避光培養；

2)滇紫草細胞超低溫處理前的預培養：將繼代培養9天的細胞轉移至含5％二甲亞砜(DMSO)的繼代培養基(與上述繼代培養基相同)上預培養6天；

3)脫水處理：以20％甘油+10％乙二醇+10％二甲亞砜+60％MS基礎培養基+0.3mol/L蔗糖為組分，配成冷凍保護劑，將細胞放入20℃冷凍保護劑中處理15min，然后在0℃預冷30min；

4)冷凍過程：將預冷好的細胞和冷凍保護劑一塊投入液氮中凍存；

5)解凍過程：從液氮中取出凍存細胞，在20℃水浴中進行解凍，然后用20℃的1.0mol/L蔗糖濃度MS培養基對細胞進行洗滌，去除冷凍保護劑；

6)細胞的復蘇：解凍后，經過洗滌的細胞轉入繼代培養基(MS基礎培養基+NAA?1.0mg/L+2，4-D?0.2mg/L)中進行恢復培養。經過上述凍存處理的滇紫草細胞存活率為71％。

實施例2：

1)滇紫草細胞的繼代培養：繼代培養基為：MS基礎培養基+NAA?1.0mg/L+2，4-D?0.2mg/L，培養條件為固體培養，pH值5.6，溫度25℃，避光培養；