[發明專利]不同區域普洱茶曬青毛茶的分子鑒別方法

無效

• 申請號: 200810058670.3
• 申請日: 2008-07-11
• 公開（公告）號: CN101353701A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 季鵬章;張俊;黃興奇
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院茶葉研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司
• 代理人: 康珉

1.一種不同區域普洱茶曬青毛茶的分子鑒別方法，由樣本DNA的提取、選擇接頭和預擴引物、AFLP引物篩選、AFLP擴增、AFLP-毛細管電泳檢測、數據處理和分析六個步驟組成，其特征在于：(1)在AFLP引物篩選中，篩選出E-AAC/M-CTG和E-AAC/M-CTA兩對擴增多態性最高的引物，用于AFLP分析，其序列如下，?

E-AAC：5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’?

M-CTG：5’-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3’?

M-CTA：5’-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3’；?

(2)在AFLP-毛細管電泳檢測中，選擇性擴增樣本檢測在CEQ8000遺傳分析系統上完成；其上樣液：甲酰胺10ul，Size?standard-6000.2ul，稀釋10倍的Sample?3ul；電壓：6KV，電流：4Ma，時間：50min；其擴增產物在高分辨率毛細管中電泳分離，激光激發熒光采集數據，電泳結果通過軟件自動統計分析并轉化為“0、1”原始數據矩陣備用；同時，導出電泳分離圖譜。?

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：在樣本DNA的提取中，樣本各取1.0g，分別按照改進的CTAB法提取總DNA，提取的總DNA樣本經RNA酶A純化后，用紫外分光光度計測定260nm和280nm下的光密度值，以確定其純度和濃度，并將總DNA濃度稀釋到200ng/ul，用于PCR反應。?

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：?

EcoR?I接頭的核苷酸序列為5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3’、3′-CTGACGCATGGTTAA-5′；?

Mse?I接頭的核苷酸序列為5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′、3′-TACTCAGGACTCAT?S′；?

EcoR?I預擴引物的核苷酸序列為5′-GACTGCGTACCAATTC-3′(E0)、5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′(E1)；?

Mse?I預擴引物的核苷酸序列為5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′(M0)、5′-GATGAGTCCTGAGTAAA-3′(M1)。?

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：在AFLP擴增中，樣本DNA經限制性內切酶EcoR?I、Mse?I分別酶切；雙酶切產物加入EcoR?I和Mse?I接頭序列和T4連接酶進行連接；連接產物加入EcoR?I和Mse?I引物進行預擴增，反應熱循環程序為：94℃預變性2min，然后進入循環，每個循環94℃變性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共20個熱循環，最后60℃延伸30min，4℃冷卻后取出；預擴增產物稀釋20倍后，加入選定的引物進行選擇性擴增；選擇性擴增為兩段循環，94℃預變性2min后，第一段循環為：94℃變性20sec，66-56℃退火30sec，72℃延伸2min，共10個熱循環；其中，退火溫度從66?℃開始，每個循環降1℃；第二段循環為：94℃變性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共20個循環，最后60℃延伸30min，冷卻后取出檢測；擴增反應在MJ?Research?PTC200-wellthermal?cycler儀上進行。?

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：得到的原始數據矩陣，用POPGENE?version1.32軟件進行遺傳多樣性分析，獲得居群遺傳多樣性以常規的多態位點百分率(P)，Nei′s基因多樣性指數He，Shannon多樣性指數Ho，基因多樣度Ht；同時，進行電泳分離圖譜的特征峰比對分析。?