[發(fā)明專利]誘導(dǎo)馬鈴薯晚疫病菌產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810058273.6
• 申請(qǐng)日: 2008-04-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101250573A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周曉罡;孫茂林;張紹松;丁玉梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所
• 主分類號(hào): C12P21/00
• 分類號(hào): C12P21/00;C12R1/645
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 金耀生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種誘導(dǎo)馬鈴薯晚疫病菌致病性分泌蛋白的方法。

背景技術(shù)

由Phytophthora?infestan引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中最嚴(yán)重的真菌性病害，世界各地的馬鈴薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，每年可造成數(shù)十億美元的損失，因此受到世界各國(guó)馬鈴薯育種學(xué)家、植物病理學(xué)家、遺傳學(xué)家的廣泛關(guān)注。馬鈴薯晚疫病菌同時(shí)還是經(jīng)典遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的良好實(shí)驗(yàn)材料，該病害系統(tǒng)是真菌-植物互作研究的模式系統(tǒng)，近年來(lái)的研究獲得了許多與侵染相關(guān)的形態(tài)分化和致病因子的遺傳資源與信息，為馬鈴薯晚疫病菌基因組學(xué)研究打下了良好基礎(chǔ)。

通過(guò)致病相關(guān)基因的功能研究，可深入了解馬鈴薯晚疫病菌的致病機(jī)制、并以此為途徑尋找馬鈴薯中與該病原菌致病基因相對(duì)應(yīng)的抗性基因，研究寄主-病原物互作機(jī)制和抗病機(jī)制，預(yù)測(cè)晚疫病菌群體中致病基因分布、多樣性栽培條件下致病基因的表達(dá)和變化、誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的功能域與致病功能域的關(guān)系，預(yù)測(cè)馬鈴薯中相應(yīng)抗病基因的抗性持久性。通過(guò)鑒定致病基因控制的致病相關(guān)因子，可以尋找殺菌劑的作用靶點(diǎn)，最終為有效控制馬鈴薯晚疫病提出新的策略。但是多年研究結(jié)果表明，目前還沒(méi)有能夠誘導(dǎo)馬鈴薯晚疫病菌產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法，從而無(wú)法確定其致病相關(guān)因子，限制了對(duì)其致病機(jī)理的深入研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服馬鈴薯晚疫病菌在固體培養(yǎng)條件下無(wú)法產(chǎn)生致病性分泌蛋白的不足，提供一種能夠誘導(dǎo)馬鈴薯晚疫病菌產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法。

本發(fā)明的誘導(dǎo)馬鈴薯晚疫病菌產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法是按以下步驟進(jìn)行：

(1)將馬鈴薯晚疫病病樣置于普通水瓊脂培養(yǎng)基，16～18℃黑暗保濕培養(yǎng)2～3天；普通水瓊脂培養(yǎng)基由以下部分組成：瓊脂粉10g/L、H₂O?1L；

(2)待病樣葉片上長(zhǎng)出灰白色霉層，用接種針挑取少量菌絲接種到普通固體培養(yǎng)基，16～18℃暗培養(yǎng)8～10天，形成較大菌落；普通固體培養(yǎng)基由以下部分組成：黑麥浸出液450ml、番茄汁150ml、瓊脂粉10g/L、CaCO3?1.2g/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制霉菌素10mg/L、H₂O?1L；

(3)用手術(shù)刀切取5塊約0.5cm²長(zhǎng)滿菌絲的瓊脂塊，轉(zhuǎn)接到100mL致病性分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，18℃，150rpm振蕩培養(yǎng)14～16天；致病性分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下部分組成：黑麥浸出液450ml、CaCO3?1.2g/L、KH2PO4?0.5g/L、MgSO4·7H2O?0.25g/L、天門冬酰胺1g/L、VB1?1mg/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制霉菌素10mg/L、H₂O?1L；

(4)用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經(jīng)4000rpm離心10min，上清液加入100％硫酸銨(697g/L)，10000rpm離心20min，沉淀經(jīng)透析處理，凍干后獲得馬鈴薯晚疫病菌致病性分泌蛋白提取物，-20℃保存；

(5)將得到的蛋白提取物用100μl除離子水溶解后，在成株期馬鈴薯葉片上進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證所提取蛋白的致病性。

本發(fā)明的有益效果是解決了馬鈴薯晚疫病菌在人工培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生致病性相關(guān)蛋白的問(wèn)題，通過(guò)對(duì)液體培養(yǎng)基配方調(diào)整，加入少量無(wú)機(jī)鹽及氨基酸，從而誘導(dǎo)馬鈴薯晚疫病菌大量產(chǎn)生致病性分泌蛋白。通過(guò)對(duì)這些分泌蛋白的分離和提純，可以深入研究晚疫病菌與馬鈴薯之間在蛋白質(zhì)水平上的相互作用，最終揭示二者在基因水平上的相互識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)等機(jī)理，對(duì)于馬鈴薯晚疫病致病機(jī)理的研究具有重要意義。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式是將分離得到的馬鈴薯晚疫病菌在普通固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入致病性分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后提取馬鈴薯晚疫病菌分泌蛋白，蛋白提取物在馬鈴薯葉片上接種，調(diào)查壞死斑。

實(shí)施例1：

將馬鈴薯晚疫病病樣置于普通水瓊脂培養(yǎng)基，16～18℃黑暗保濕培養(yǎng)2～3天；普通水瓊脂培養(yǎng)基由以下部分組成：瓊脂粉10g/L、H₂O?1L；