[發(fā)明專利]G6PD缺陷型A375穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株及其構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810058064.1
• 申請(qǐng)日: 2008-01-25
• 公開（公告）號(hào): CN101289654A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱月春;李丹怡;呂會(huì)茹;楊銀峰;童淑芬;李治綱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/11;C12N15/86
• 代理公司: 云南派特律師事務(wù)所
• 代理人: 張怡

1、一種G6PD缺陷型A375穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，其特征在于是將A375細(xì)胞株經(jīng)siRNA-慢病毒表達(dá)系統(tǒng)靶向沉默了內(nèi)源性G6PD的表達(dá)量80％以上，并含有DNA雙鏈片段5′-GATCCCGCCTCAGTGCCACTTGACATTGATATCCGTGTCAAGTGGCACTGAGGCTTTTTTCCAAC-3′和5′-TCGAGTTGGAAAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACACGGATATCAATGTCAAGTGGCACTGAGGCGG-3′，以及綠色熒光蛋白GFP基因的能發(fā)綠色熒光的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，所述的G6PD缺陷型A375穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建方法，由以下步驟組成：

一、siRNA序列、DNA模板的設(shè)計(jì)與合成

用OligoEngine?RNAi軟件設(shè)計(jì)針對(duì)人G6PD基因3’端非編碼區(qū)的siRNA：5′-GCCTCAGTGCCACTTGACA-3′，并以siRNA無關(guān)序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′為對(duì)照，再分別合成兩條互補(bǔ)并含siRNA或?qū)φ招蛄械恼x鏈和反義鏈的DNA模板，中間以10個(gè)脫氧核苷酸的Loop結(jié)構(gòu)相連，后接RNA?PolyIII轉(zhuǎn)錄中止點(diǎn)，并在兩端引入BamH?I和Xho?I酶切位點(diǎn)；對(duì)應(yīng)于人G6PD基因3’端非編碼區(qū)的siRNA的DNA模板是5′-GATCCCGCCTCAGTGCCACTTGACATTGATATCCGTGTCAAGTGGCACTGAGGCTTTTTTCCAAC-3′和5′-TCGAGTTGGAAAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACACGGATATCAATGTCAAGTGGCACTGAGGCGG-3′；而對(duì)應(yīng)于對(duì)照序列的DNA模板是5′-GATCCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTCCAAA-3’和5’-AGCTTTTGGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAACGG-3’；

二、構(gòu)建siRNA的慢病毒表達(dá)載體

上述DNA模板分別經(jīng)稀釋、退火，與線性質(zhì)粒pRNAT-U6.2/Lenti連接；再轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，涂布平板，過夜培養(yǎng)；每組樣品挑取兩個(gè)單菌落經(jīng)PCR檢測(cè)，PCR條件為：94℃10min→94℃30s→55℃30s→72℃30s，共33個(gè)循環(huán)；過夜培養(yǎng)陽性菌落，提取質(zhì)粒測(cè)序鑒定，對(duì)于測(cè)序正確的陽性克隆，提取純化不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒DNA；

三、慢病毒顆粒的包裝和病毒液的生產(chǎn)

用慢病毒包裝質(zhì)粒混合物和siRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；24小時(shí)換為含1％FBS的DMEM培養(yǎng)液；48小時(shí)收集細(xì)胞，5000rpm離心5min，0.45μm的PVDF膜過濾上清液后用作待測(cè)病毒液；以標(biāo)準(zhǔn)病毒液1×10⁸cfu/L為對(duì)照，兩組樣品按感染復(fù)數(shù)值設(shè)5個(gè)梯度：1、3、5、10和20；感染24小時(shí)觀察綠色熒光細(xì)胞的強(qiáng)度和數(shù)量以確定病毒滴度，若表達(dá)GFP的細(xì)胞超過95％，病毒液滴度達(dá)1.0×10⁸cfu/L可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

四、病毒顆粒感染A375細(xì)胞并篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

接種生長狀態(tài)良好的A375細(xì)胞至6孔板，用無抗生素、含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃和5％CO₂培養(yǎng)至70-80％的細(xì)胞貼壁；加入病毒液緩慢混勻，24小時(shí)換液；84-120小時(shí)用500ng/ul的G418篩選；168-200小時(shí)挑出單克隆，轉(zhuǎn)移到24孔板；24小時(shí)換含抗生素的培養(yǎng)基；當(dāng)70-80％的細(xì)胞貼壁時(shí)，轉(zhuǎn)到6孔板中再培養(yǎng)；細(xì)胞克隆生長良好時(shí)，逐步放大培養(yǎng)；將穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株反復(fù)凍存觀察其熒光表達(dá)是否穩(wěn)定，在體外已傳代15-20代，熒光表達(dá)穩(wěn)定，siRNA沉默G6PD表達(dá)80％以上，成為G6PD缺陷型A375穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。