[發明專利]一種檢測DNA單核苷酸多態性的方法

無效

• 申請號: 200810057569.6
• 申請日: 2008-02-03
• 公開（公告）號: CN101220395A
• 公開（公告）日: 2008-07-16
• 發明（設計）人: 王樹;段新瑞
• 申請（專利權）人: 中國科學院化學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢;任鳳華

1.一種DNA單核苷酸多態性的檢測方法，依次包括以下步驟：

1)以待測樣本的DNA為模板進行PCR擴增，并用熒光物質標記待測樣本的DNA；

2)通過所述熒光物質與下述式(I)的化合物熒光共振能量轉移情況確定所述待測DNA的目標單核苷酸多態位點的核苷酸；所述熒光物質的吸收光譜與所述式(I)的化合物發射光譜有較好的重疊，光譜重疊積分范圍為1.0×10^-15～3.0×10^-13M^-1cm³；

式(I)中，R代表鏈端含有四級胺的直鏈或支鏈的烷基，所述烷基的主鏈長為2-12個碳，X代表鹵素；

所述式(I)化合物的數均分子量為5000-100000。

2.如權利要求1所述的方法，其特征為：所述式(I)中，R為6-三甲胺基己基、6-三乙胺基己基、5-三甲胺基戊基、5-三乙胺基戊基、4-三甲胺基丁基、4-三乙胺基丁基、3-三甲胺基丙基和3-三乙胺基丙基中的任意一種。

3.如權利要求1所述的方法，其特征為：所述式(I)中，X為氯、溴和碘中的任意一種。

4.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征為：所述用熒光物質標記步驟1)的DNA的方法為：用熒光物質標記的dNTP或ddNTP對PCR擴增產物進行單堿基延伸；所述dNTP或ddNTP為與所述目標單核苷酸多態位點的核苷酸相鄰的一個核苷酸互補的dNTP或ddNTP。

5.如權利要求4所述的方法，其特征為：所述單堿基延伸中，所用的引物有兩種：野生型特異性引物和突變型特異性引物；所述野生型特異性引物的末端核苷酸與所述目標單核苷酸多態位點的野生型核苷酸互補；所述突變型特異性引物的末端核苷酸與所述目標單核苷酸多態位點的突變型核苷酸互補；所述引物能與目標單核苷酸多態位點相鄰20-25bp的序列互補。

6.如權利要求5所述的方法，其特征為：確定所述待測DNA的目標單核苷酸多態位點核苷酸的方法為：若只在使用野生型特異性引物時出現熒光共振能量轉移，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態位點的核苷酸為野生純合型；若只在使用突變型特異性引物時出現熒光共振能量轉移，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態位點的核苷酸為突變純合型；若使用兩種引物都出現熒光共振能量轉移，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態位點的核苷酸為雜合型。

7.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征為：所述用熒光物質標記步驟1)的DNA的方法為：用熒光物質A標記與所述目標單核苷酸多態位點的野生型核苷酸互補的dNTP或ddNTP，用熒光物質B標記與所述目標單核苷酸多態位點的突變型核苷酸的互補dNTP或ddNTP，用所述熒光物質A標記的dNTP或ddNTP和熒光物質B標記的dNTP或ddNTP同時對PCR擴增產物進行單堿基延伸；

在同一激發光的作用下，所述熒光物質A和所述熒光物質B產生的熒光的波長至少相差40nm。

8.如權利要求7所述的方法，其特征為：所述單堿基延伸中，所用的引物能與所述目標單核苷酸多態位點相鄰(上游或下游)20-25bp的序列互補。

9.如權利要求7或8所述的方法，其特征為：確定所述待測DNA的目標單核苷酸多態位點核苷酸的方法為：若單獨出現PFP到熒光物質A的熒光共振能量轉移，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態位點的核苷酸為野生純合型；若單獨出現PFP到熒光物質B的熒光共振能量轉移，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態位點的核苷酸為突變純合型；若兩種熒光共振能量轉移都出現，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態位點的核苷酸為雜合型。

10.如權利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述熒光物質為熒光素、羅丹明、溴乙啶、Cy3或Cy5。