[發(fā)明專利]抗西尼羅病毒膜蛋白E的單克隆抗體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810056752.4
• 申請日: 2008-01-24
• 公開（公告）號: CN101235085A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高福;田克恭;劉俊娥;曹振
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所;農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N5/18;G01N33/577
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗西尼羅病毒膜蛋白E的單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

西尼羅病毒(West?Nile?Virus，WNV)感染可引起西尼羅熱、西尼羅病毒性腦炎和腦膜炎，是一種人畜共患、自然疫源性、急性傳染病。自1999年WNV在美國紐約爆發(fā)以來，該病毒已經(jīng)迅速傳播到世界多個國家和地區(qū)，成為嚴(yán)重威脅人類健康的病毒性疾病，引起了全球公共衛(wèi)生界的關(guān)注。WNV可以感染多種蚊蟲和鳥類，并通過蚊蟲和鳥類的交替感染將病毒沿著鳥類遷徙的路徑進(jìn)行傳播；蚊蟲還可以通過叮咬被WNV感染的鳥類將WNV傳染給多種哺乳動物，如人類、馬、狗、貓和家禽如雞、鵝等；該病毒還可以通過輸血、器官移植、哺乳及胎盤垂直傳播。截至目前全球已有兩萬多人感染W(wǎng)NV，發(fā)病率在20％以上，與以前的WNV感染相比，重癥病例明顯增加，死亡率上升為5-15％。

目前對WNV感染的治療還沒有特效藥物，早期發(fā)現(xiàn)是控制WNV傳播的主要措施。WNV已經(jīng)在世界多個國家和地區(qū)發(fā)生多次的反復(fù)流行，雖然我國目前還沒有WNV感染的報道，根據(jù)美國CDC發(fā)布的WNV在全球的地理分布圖顯示，我國西部的部分地區(qū)已經(jīng)受到WNV入侵的威脅；而且，與我國毗鄰的俄羅斯在1999年就爆發(fā)過WNV。由于WNV可以通過遷徙的鳥類進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，同時也可能通過牲畜的進(jìn)口貿(mào)易進(jìn)入我國，且我國存在WNV流行的自然和社會因素，因此我國需盡快發(fā)展有效的WNV檢測試劑和檢測方法，及時建立WNV監(jiān)測體系，防止WNV的傳入和流行。

西尼羅病毒是蟲媒病毒之一，屬于黃病毒科黃病毒屬，與日本腦炎病毒(Japanese?Encephalitis?Virus，JEV)和登革熱病毒(Dengue?Virus，DEV)等屬于同一個復(fù)合組，其病毒粒子表面有兩個膜蛋白：M蛋白和E蛋白。其中E蛋白是主要的膜蛋白，與病毒和受體細(xì)胞的識別、結(jié)合和病毒的毒力有關(guān)。晶體結(jié)構(gòu)分析表明E蛋白包含三個結(jié)構(gòu)域：即結(jié)構(gòu)域I、II和III，其中結(jié)構(gòu)域III(EDIII)被認(rèn)為是誘導(dǎo)病毒特異性抗體和中和抗體的主要抗原表位。由于黃病毒屬成員的E蛋白上存在很多共同的抗原表位，所以在進(jìn)行血清學(xué)檢測時常常出現(xiàn)交叉反應(yīng)，其抗體的中和活性也有一定的交叉性，使得血清檢測反應(yīng)的特異性大大降低；而JEV在我國多個地區(qū)發(fā)生過流行，因此，黃病毒屬病毒感染的血清學(xué)檢測具有很大的局限性，只能作為初篩的檢測指標(biāo)之一。

WNV抗原的檢測可以通過細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)和噬斑滴定、傳統(tǒng)的RT-PCR、實(shí)時熒光RT-PCR和免疫組織化學(xué)等方法進(jìn)行。其中RT-PCR和實(shí)時熒光RT-PCR可以快速檢測病毒抗原，但該方法成本昂貴，容易出現(xiàn)由于樣品污染而呈假陽性結(jié)果；通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離病毒和檢測樣品中的病毒噬斑也可以檢測病毒抗原，但該方法檢測周期長，且需要專業(yè)的技術(shù)人員以及BSL-3生物安全試驗(yàn)室，因而在大范圍檢測中難以普及；而利用抗原捕獲ELISA、間接免疫熒光、免疫組化等方法可以快速、靈敏地檢測WNV抗原，適于在大規(guī)模的監(jiān)測系統(tǒng)中應(yīng)用。

抗原捕獲ELISA、間接免疫熒光、免疫組化等檢測方法的應(yīng)用依賴于針對WNV抗原特異性的單克隆抗體的研制。國外學(xué)者利用滅活的WNV、DNA疫苗和WNV?E蛋白的胞外區(qū)作為抗原免疫小鼠制備的單克隆抗體中，部分單抗與黃病毒科的其它成員有不同程度的交叉反應(yīng)，但沒有用復(fù)性的EDIII作為抗原制備單克隆抗體的報道。面對WNV可能入侵我國并進(jìn)行傳播的威脅，需要及時建立有效的WNV檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供抗西尼羅病毒膜蛋白E的單克隆抗體。

本發(fā)明所提供的抗西尼羅病毒膜蛋白E的單克隆抗體是WNV-2F5′或WNV-4B3′。其中，WNV-2F5′是由保藏號為CGMCC?No.2261的鼠源雜交瘤細(xì)胞株WNV-2F5分泌的，WNV-4B3′是由保藏號為CGMCC?No.2262的鼠源雜交瘤細(xì)胞株WNV-4B3分泌的。

鼠源雜交瘤細(xì)胞株WNV-2F5已于2007年11月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC?No.2261。鼠源雜交瘤細(xì)胞株WNV-4B3已于2007年11月26日保藏于CGMCC，保藏號為CGMCC?No.2262。以上兩種鼠源雜交瘤細(xì)胞株WNV-2F5和WNV-4B3也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述抗西尼羅病毒的單克隆抗體與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的抗原決定簇位于西尼羅病毒膜蛋白E的第三結(jié)構(gòu)域。