[發明專利]一種牛卵母細胞體外成熟無血清培養基

無效

• 申請號: 200810056639.6
• 申請日: 2008-01-23
• 公開（公告）號: CN101225373A
• 公開（公告）日: 2008-07-23
• 發明（設計）人: 王海;張家新;張紅霞;安晶;張向利;吳亦芳;趙孟彬;王玉忠
• 申請（專利權）人: 北京錦繡大地農業股份有限公司
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明屬于細胞生物學領域，涉及一種牛卵母細胞體外成熟無血清培養基。

背景技術

動物細胞培養是一種應用最為廣泛的體外培養技術，該技術起源于19世紀。1885年科學家把雞胚的神經板在溫熱的鹽水中成功地維持存活了若干天，是首次體外培養的嘗試。隨著抗菌素、合成培養液、胰蛋白酶處理技術的發展以及器皿的改進，動物細胞培養技術得到了飛速的發展。培養液的選擇和配制是體外培養技術的一個關鍵環節。一般培養液由2部分組成：基礎培養基和血清。

基礎培養基??自行配制或用現成的化學合成培養基，常用的化學合成培養基有Eagle(包括BME、MEM、DME等)、F10、F12、TCM199、RPMI1640、EBSS、HBSS等等。這些化學合成培養基具有適當的滲透壓、能源、氨基酸、維生素、微量元素及緩沖pH值，可以滿足許多類型培養細胞的最基本的需要，它雖可維持細胞一段時間的存活，但由于缺乏細胞有絲分裂所必需的各種激素和生長因子，細胞不能在這類相當于平衡鹽溶液的體系中進行分裂。要想使細胞進一步增生、生長必須添加血清。

血清??可以提供細胞生長所需的各種激素和生長因子，目前已成為維持細胞有絲分裂不可缺少的物質。常用的血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人血清和馬血清等。培養基中血清的濃度范圍為5～20％，以10％濃度最為常用。但血清有一系列缺點，特別是它的易變性和非限定性，給實驗工作帶來了難以精確定量和難以重復等困難。因此，盡管它的應用已有相當長久的歷史，但決不是理想的培養基成分。

20世紀60年代利伯曼和奧維等首先進行了無血清培養的嘗試，經山根、佐藤春太郎等科學家的研發，一些無血清培養基(又稱無血清限定培養基或簡稱限定培養基)已經在一些細胞培養中開始使用。這類培養基主要以各種激素(如胰島素、各種前列腺素、生長激素等)、生長因子(如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、神經生長因子、MSA等)、維生素、載體蛋白如轉鐵蛋白(銅藍蛋白等)、微量元素(鎘、硒等)、乙醇胺以及貼壁與展開因子(如昆布氨酸、纖維網素等)取代含血清培養基中的血清部分。這樣，不但排除了血清的干擾，而且，還可以在更接近體內的條件下維持細胞的功能和活力。山根等發現，不同組織學類型的細胞所需要的活性物質完全不同，而不同動物的同一組織學類型的細胞所需要的活性物質則極為類似，僅在量上有所區別。據此，他們提出“組織定型專一培養基”的概念，以圖設計出專一地適用于各種細胞類型的無血清培養基。可以預料，由于無血清培養基的發展，許多有關細胞培養的生物學研究工作將由定性研究進展到定量研究。

隨著奶牛業的發展，牛的胚胎工程也發展迅速，體外大規模生產胚胎成為可能。但是體外生產的胚胎，胎牛體形偏大，常常造成難產，給生產造成巨大的損失，嚴重制約著牛胚胎體外生產和胚胎移植的產業進一步向前發展。大量研究表明，培養液內添加血清是造成牛胎兒肥大綜合癥的主要因素之一。一些印跡基因調控著胎兒的體重，如Igf2，H19和Igf2r等基因，而血清對印跡基因正常表達有著不利影響。在早期胚胎發育中發現，這些基因在無血清培養胚胎的mRNA豐度遠遠高于含血清培養的胚胎，可見血清影響了這些基因的正常轉錄。所以用含有血清培養基生產的胚胎，移植后出生的個體往往是體重偏大。此外，血清中一些成份不利于胚胎基因的正常表達，進而影響胚胎進一步發育，造成體外胚生產牛胎妊娠率和產犢率低。盡管血清可以提供體外卵母細胞生長發育所需的營養物質，但它的副作用也是不容忽視的。用含有血清的培養液培養卵母細胞會導致胞質內脂滴增多，線粒體數量下降，嚴重地影響受精后胚胎的脂肪和能量新陳代謝，干擾了胚胎發育過程基因正常表達，致使胚胎的質量下降，所以用含有血清培養液生產的胚胎，其妊娠率和產犢率有所降低。

另外在一些特定實驗情況下，如需觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時很難排除血清中生長因子的干擾作用。血清含有蛋白成分誘導細胞在培養過程中分泌某種物質(抗體、生長因子)，這些產物和血清內的蛋白成分影響了卵母細胞的正常生長發育。

總之，無血清培養劑這一新技術在細胞生物學方面應用的前途是無限廣闊的，它不僅有利于探討和闡明細胞體外培養生理、生化和成分生物合成等一系列問題，而且一些生產中問題得以解決，將可以為防病治病做出很大的貢獻。

發明內容

本發明針對血清對牛卵母細胞體外成熟的缺陷，提供一種牛卵母細胞體外成熟無血清培養基IVMBM-I，不僅有利于闡明培養基成分對卵母細胞發育的作用，也能克服目前牛胚胎生物工程中存在的一些問題。