[發明專利]鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的提取、純化方法

無效

• 申請號: 200810055697.7
• 申請日: 2008-01-07
• 公開（公告）號: CN101220086A
• 公開（公告）日: 2008-07-16
• 發明（設計）人: 王效義;王棠;朱紫雯;祁芝珍;吳本傳;郭兆彪;楊永海;崔百忠;王祖隕;王虎;楊瑞馥
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: C07K14/24
• 分類號: C07K14/24;A61K39/02;A61P31/04;G01N33/569;G01N33/53
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 魯兵

1.鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的提取、純化方法，是先從鼠疫耶爾森氏菌培養物中分離培養上清和菌體沉淀，再利用飽和硫酸銨沉淀從培養上清中以及利用玻璃珠從菌體沉淀中分別提取出多部分鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原粗蛋白，再將各部分鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原粗蛋白各自通過飽和硫酸銨沉淀、凝膠過濾得到多部分純化的鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原。

2.根據權利要求1所述的提取、純化方法，其特征在于：所述鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的提取、純化方法，包括以下獲取第一部分至第四部分任意一種鼠疫耶爾森氏菌天然F1目標抗原的必要步驟：

1)鼠疫耶爾森氏菌的培養：將鼠疫耶爾森氏菌接種到添加質量/體積百分濃度為0.1-0.3％木糖的心腦浸液培養基中，在35-40℃下培養12-96h；

2)對步驟1)得到的鼠疫耶爾森氏菌培養物進行離心，分離出培養上清和菌體沉淀；

3)鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原粗蛋白的提?。簩⒉襟E2)分離出的上清用30-50％飽和硫酸銨沉淀，鹽析，再離心，分離出上清和沉淀，棄掉上清，得到A部分粗蛋白；將步驟2)分離出的菌體沉淀用PBS緩沖液重懸后，加入玻璃珠，在35-40℃、100-400rpm下振搖12-24h，再離心，分離出用于提取B部分和C部分粗蛋白的上清和用于提取D部分粗蛋白的菌體沉淀；將用于提取B部分和C部分粗蛋白的上清用30-50％飽和硫酸銨沉淀，鹽析，再離心，棄掉上清，將沉淀用0.005-0.015M的PB緩沖液重新溶解后，再用20-30％飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，分離出含B部分粗蛋白的上清和含C部分粗蛋白的沉淀；將用于提取D部分粗蛋白的菌體沉淀重懸于0.005-0.015M的PBS緩沖液中，超聲，離心，棄掉沉淀，將上清用30-50％飽和硫酸銨沉淀，鹽析，再離心，分離出上清和沉淀，棄掉上清，得到D部分粗蛋白；

4)將步驟3)獲得的A部分粗蛋白溶于0.005-0.015M的PBS緩沖液中后，用20-30％飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉沉淀，將上清再用1-10％飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉上清，將沉淀溶于0.005-0.015M的PBS緩沖液中，過Sephacryl?S-200HR凝膠柱，洗脫液為pH?7.5-8.5、0.005-0.015M的Tris-HCl緩沖液，透析，得到第一部分天然F1抗原純化蛋白。

5)將步驟3)獲得的含B部分粗蛋白的上清用1-10％飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉上清，將沉淀重新溶于0.005-0.015M的PB緩沖液中，過Sephacryl?S-200HR凝膠柱，洗脫液為pH?7.5-8.5、0.005-0.015M的Tris-HCl緩沖液，透析，得到第二部分天然F1抗原純化蛋白；

6)將步驟3)獲得的含C部分粗蛋白的沉淀溶于0.005-0.015M的PB緩沖液中，再用20-30％飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉沉淀，將上清用1-10％飽和硫酸銨沉淀，離心，棄掉上清，將沉淀重新溶于0.005-0.015M的PB緩沖液中，過SephacrylS-200HR凝膠柱，洗脫液為pH?7.5-8.5、0.005-0.015M的Tris-HCl緩沖液，透析，得到第三部分天然F1抗原純化蛋白；

7)將步驟3)獲得的D部分粗蛋白溶于0.005-0.015M的PB緩沖液中，用20-30％飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉沉淀，將上清用1-10％飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉上清，將沉淀重新溶于0.005-0.015M的PB緩沖液中，過Sephacryl?S-200HR凝膠柱，洗脫液為pH?7.5-8.5、0.005-0.015M的Tris-HCl緩沖液，透析，得到第四部分天然F1抗原純化蛋白；

第一至第四部分天然F1抗原純化蛋白中的一種或它們之間任意幾種組合的混合產物構成所要的鼠疫耶爾森氏菌天然F1目標抗原。

3.根據權利要求2所述的提取、純化方法，其特征在于：所述步驟1)中的鼠疫耶爾森氏菌為鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株、A1122株、EV40疫苗株、Tjiwidej株、M23、P175或Otten。

4.根據權利要求2所述的提取、純化方法，其特征在于：所述心腦浸液培養基中木糖的質量/體積百分濃度為0.2％；鼠疫耶爾森氏菌的培養溫度為37℃，培養時間為72h。