[發明專利]細胞增殖相關基因CNKSR3與篩選方法及其應用

無效

• 申請號: 200810054129.5
• 申請日: 2008-08-15
• 公開（公告）號: CN101348788A
• 公開（公告）日: 2009-01-21
• 發明（設計）人: 楊榮存;曾彬
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12Q1/68;C40B50/06;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司
• 代理人: 侯力

【技術領域】

本發明屬于生物工程與生物醫藥技術領域。具體涉及基于細胞增殖相關siRNA干涉文庫篩選細胞增殖相關基因CNKSR3的方法及其應用。

【背景技術】

人類基因組計劃已經完成，但是人類染色體大多數基因的功能仍然不清楚。主要原因是缺乏能夠大規模、高通量進行功能基因掃描的手段和策略。

Winzeler?EA等人在啤酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)基因組序列的測序成功之后，利用酵母基因敲除技術構建了大約6925株不同的精確敲除單個開放閱讀框(open?readingframe，ORF)(Brown，Dorfman?et?al.)的缺失型菌株，使得系統性地研究啤酒酵母基因組中這些開放閱讀框的功能成為可能。而在模式生物線蟲(Caenorhabditis?elegans)和果蠅(Drosophila?melanogaster)中，RNA干擾現象(Fire，Xu?et?al.1998；Kennerdell?and?Carthew1998)的發現使得在這些模式生物中對未知功能基因進行大規模功能缺失(loss-of-function)研究成為可能。

RNA干擾是轉錄后序列特異性的基因沉默過程(Tuschl，Zamore?et?al.1999)，由雙鏈的RNA分子所介導(Zamore?and?Haley?2005)。目前研究證實：一種叫做Dicer的核酸酶能夠切割長的雙鏈RNA，產生19-29bp左右的短雙鏈RNA，稱為siRNA。siRNA的一條鏈作為RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced?silencing?complex，RISC)的模板同互補的mRNA結合，并使其被降解(Meister?and?Tuschl?2004)。

RNA干擾能夠有效地抑制特定基因的表達，且這種干擾機制在哺乳動物中也廣泛存在(Harborth，Elbashir?et?al.2001)。因此RNA干擾不但成為高等生物功能組基因學研究中的重要工具；也成為大規模、高通量地在哺乳動物細胞或者組織中進行功能缺失性(loss-of-function)掃描的主要手段(Miyagishi?and?Taira?2003)。

目前，利用化學合成的siRNA構建的RNA干涉文庫，人們已經發現TRAIL誘導的細胞凋亡過程起到重要調節作用的基因家族(Ren，Wagner?et?al.2004)，以及同細胞生存相關基因(Murphy，MacKeigan?et?al.2004)、同內吞作用相關的激酶基因等(Pelkmans，Fava?et?al.2005)。

除了化學合成的siRNA，另一個方法就是構建以表達siRNA質粒為基礎的RNA干涉文庫，進行大規模高通量的基因功能研究和篩選。RNA干涉現象被發現不久，一些實驗室就已經開始研究siRNA表達質粒。他們研究發現：RNA聚合酶III啟動子序列的質粒，能夠通過單一或者雙向的RNA聚合酶III啟動子序列，在真核細胞體內長期持久地表達shRNA(單一啟動子)和siRNA(雙向啟動子)，并且無論是shRNA還是siRNA都能夠有效地抑制特定基因的表達(Kaykas?and?Moon?2004；Miyagishi，Matsumoto?et?al.2004)。利用這一技術，Berns和他的同事們構建大約23,742個獨立的shRNA表達質粒，這些質粒靶向人類7,914個不同基因。并且通過在人類細胞中進行大規模的掃描，他們發現了1個已知功能和5個未知功能基因，這些基因可能在依賴于p53引起的細胞周期阻滯起著重要調節作用(Berns，Hijmans?et?al.2004)。Kaykas和他的同事們也證實：由他們構建完成的pHippy的雙向啟動子siRNA表達載體能夠有效地沉默連接了熒光素酶報告基因的PGL3基因(Kaykas?and?Moon?2004)。

因此，利用siRNA干涉文庫對新功能基因進行掃描，是發現新功能基因的重要手段。

利用雙向啟動子的siRNA表達載體，我們組建了靶向人類胚胎干細胞和造血干細胞增殖、分化相關基因的siRNA干涉文庫。目前，我們的文庫含有近450個載體，靶向225個人類基因。我們利用一部分文庫(包含70個基因(20個轉錄因子，50個未知功能蛋白))對細胞增殖相關基因進行新功能基因的篩選(Ghildiyal，Seitz?et?al.2008)。并發現了能夠影響細胞增殖的新功能基因—CNKSR3