[發(fā)明專利]多年生黑麥草上三種腥黑粉菌近似種的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810053816.5
• 申請日: 2008-07-11
• 公開（公告）號: CN101328496A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發(fā)明（設計）人: 廖芳;黃國明;羅加鳳;劉躍庭;崔鐵軍;劉勇
• 申請（專利權）人: 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 天津市鼎和專利商標代理有限公司
• 代理人: 李鳳

1.一種利用PCR引物對多年生黑麥草(Lolium?perenne?L.)上的小麥矮腥黑穗菌(Tilletia?controversa?Kühn，簡稱TCK)、黑麥草腥黑粉菌(T.lolli)和T.vankyi進行檢測的方法，這些引物既可以對這三種腥黑粉菌進行檢測，又可以將它們區(qū)分開來，其特征在于，引物的序列和用途如下：

(1)腥黑粉菌屬(Tilletia)通用引物，引物序列如下：

通用外套引物：IGSUF1：GGA?TGC?ATT?CTG?GGG?ACG?T

??????????????IGSUR1：GTA?GCC?TTG?TTG?CTA?CGA?TCT?G

通用內(nèi)套引物：NIGSUF1：CAC?CGC?CCA?AGC?ACG?TAC

??????????????NIGSUR1：GAC?CTT?TTG?GGG?TCA?AAC?TTC?TC

通用外套引物用于菌絲基因組DNA或冬孢子套式擴增，擴增片段約為900bp，通用內(nèi)套引物用于冬孢子的套式擴增，擴增片段約為700bp，這兩套引物用于TCK、T.lolli和T.vankyi的檢測；

(2)TCK、T.lolli、T.vankyi各自的特異引物和T.vankyi的外套引物，引物序列如下：

TCK的外套引物：IGSUF1/IGSUR1

TCK的特異引物：LSKF：GAA?GTT?TCC?TTC?GCC

???????????????LSKR：ACT?TCT?CTC?GGA?ACA?TCA?CTG?T

特異引物的擴增片段約為800bp，這兩套引物用于TCK的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增，

T.lolli的外套引物：IGSUF1/IGSUR1

T.lolli的特異引物：LSLF：GGT?GGA?CTG?ACA?TTC?GTC

???????????????????LSLR：CGC?ATG?TCC?GTC?GGA?CCG

特異引物的擴增片段約為250bp，這兩套引物用于T.lolli的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增，

T.vankyi外套引物：unF：AAC?TGT?ATG?GAT?CAT?CCA?GAG?C

??????????????????unR：GTA?ATG?CCA?GAG?GAT?TGT?CCT

T.vankyi特異引物：LSNF：CTC?TGT?GAG?GAT?ATG?CCA

??????????????????LSNR：GAG?AAT?AAC?TGT?TGT?ATG?ATG?CCA

特異引物的擴增片段約為550bp，這兩套引物用于T.vankyi的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增；

TCK、T.lolli、T.vankyi三者的特異引物，用于菌絲基因組DNA三重特異性PCR擴增，特異性檢測這三種菌絲體，各自的外套引物與特異引物的三重套式PCR擴增，用于特異性檢測這三種真菌的冬孢子。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用PCR引物對多年生黑麥草(Lolium?perenne?L.)上的小麥矮腥黑穗菌(Tilletia?controversa?Kühn，簡稱TCK)、黑麥草腥黑粉菌(T.lolli)和T.vankyi進行檢測的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)實驗材料冬孢子的萌發(fā)和菌絲的培養(yǎng)；

(2)菌絲基因組DNA的提取；

(3)冬孢子的挑取與破碎；

(4)菌絲基因組DNA三重PCR檢測方法的建立；

(5)冬孢子三重套式PCR檢測方法的建立。

3.權利要求1和2所述的一種檢測多年生黑麥草上小麥矮腥黑穗菌、黑麥草腥黑粉菌和T.vankyi的方法以及12條引物在檢測這三種腥黑粉菌方面的應用。