[發明專利]磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法

有效

• 申請號: 200810053813.1
• 申請日: 2008-07-11
• 公開（公告）號: CN101319203A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 黎明;路福平;杜連祥;張業尼;李玉;王建玲;王春霞
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12R1/125
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司
• 代理人: 王來佳

1.一種磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1).制備粗發酵液

將工程菌接種至LB液體培養基中，36～38℃振蕩培養10～14h，培養后產物按3～7％的接種量轉接至相同培養基中繼續培養2～3h，然后加入10～20％的蔗糖水溶液，誘導26～30h，誘導后產物在3～5℃、8000r/min的條件下離心15～25min，收集上清，制得粗發酵液；

(2).鹽析

粗發酵液在3～5℃、8000r/min的條件下離心15～25min，收集上清，加入硫酸銨至75％飽和度，3～5℃靜置10～14h后，在3～5℃、8000r/min的條件下離心15～25min，傾去上清，沉淀溶于pH?7.0、10mM的Tris-HCl緩沖液中；

(3).脫鹽

將第(2)步的產物采用截流分子量為10kDa～20kDa的中空纖維膜進行超濾濃縮；

(4).SP-Sepharose?HP離子交換層析

采用pH?7.0、10mM的Tris-HCl緩沖液平衡層析柱，將脫鹽后的活性組分用同樣的緩沖液溶解，8000r/min離心15～25min，取上清，上樣1～3mL后先用該緩沖液洗脫未吸附的蛋白，再用含0～1mol/L?NaCl的該緩沖液進行梯度洗脫，收集活性組分；

(5).Sephadex?G-75凝膠層析

離子交換層析得到的活性組分，先用含1.0％NaCl的Tris-HCl緩沖液溶解，8000r/min離心15～25min，取上清，上樣1～3mL后用相同緩沖液進行洗脫，收集的活性組分即為磷脂酰絲氨酸合成酶，

所述的工程菌是保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC?1.1395的枯草芽孢桿菌。

2.根據權利要求1所述的磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，其特征在于：所述的步驟(1)中的LB培養基含有濃度為30μg/mL的卡那霉素。

3.根據權利要求1所述的磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，其特征在于：所述的步驟(1)中的蔗糖水溶液的濃度為20％。

4.根據權利要求1所述的磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法，其特征在于：所述的步驟(4)和(5)中的洗脫條件為：洗脫速度0.5mL/min，每管收集2mL。?