[發明專利]磷脂酰絲氨酸合成酶催化合成磷脂酰絲氨酸的方法

無效

• 申請號: 200810053812.7
• 申請日: 2008-07-11
• 公開（公告）號: CN101319237A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 路福平;杜連祥;張業尼;李玉;王建玲;王春霞
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及一種磷脂酰絲氨酸合成酶催化合成磷脂酰絲氨酸的方法。

背景技術

磷脂酶D，即磷脂酰膽堿磷脂水解酶(EC3.1.4.4)，屬于催化磷酸二脂酯鍵水解和堿基交換反應的一類酶的總稱，其主要生理功能是參與細胞脂質代謝、信號轉導及生物膜形成等。

磷脂酰絲氨酸合成酶(phosphatidylserine?synthase，PSS)是磷脂酶D家族成員之一，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，目前在細菌、酵母和哺乳動物細胞中均有發現。其中，源自大腸桿菌的磷脂酰絲氨酸合成酶具有該家族明顯的序列特征，即含有兩個間隔出現的H(x)K(x)₄D保守序列，它能夠催化合成大腸桿菌自身所需的大部分磷脂類物質，而不同于其它革蘭氏陰性菌的磷脂類物質合成酶，并不緊密連接于細胞膜結構。對其進一步定位研究發現，該酶是一種外膜蛋白，主要通過脂類底物和弱酸性磷脂物質的電子傳遞鏈與膜表面互相作用。

但是磷脂酰絲氨酸合成酶(PSS)在大腸桿菌中含量低(不到蛋白總含量的0.1％)，不利于直接工業化發酵生產；而枯草芽孢桿菌表達系統是一種較為理想的異源蛋白表達系統，可以高效地表達具有生物活性的異源蛋白并將其分泌到培養基中，且具有較高的生物安全性。本發明采用枯草芽孢桿菌系統表達磷脂酰絲氨酸合成酶基因，解決了出發菌株磷脂酰絲氨酸合成酶(PSS)表達量低的問題，適用于工業化生產。

磷脂酰絲氨酸合成酶具有水解和轉酯雙重活性，既可水解卵磷脂(PC)形成磷脂酸(PA)和膽堿；又可在高濃度絲氨酸、乙醇胺等親核物質存在下，催化轉酯反應生成具有不同極性頭部的稀有磷脂——磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。應用同位素標記技術對酶的反應機理研究發現，該酶表現出ping-pong反應機制，在水相和底物積聚相的相界面對底物進行“修飾”。

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)是一種天然的磷脂，于1942年由Jordi?Folch首次提取并加以定性，它并非單一成分，而是一組化合物。磷脂酰絲氨酸的結構決定了其具有雙親性的獨特性質，帶有負電荷的一端具有親水性(或水溶性)，由脂肪酸組成的另一端具有親脂性(或脂溶性)。作為磷脂家族中的一員，它是唯一能夠調控細胞膜關鍵蛋白功能狀態的磷脂，有著獨特的理化性質和營養價值：(1)提高認知能力，特別是識別、學習、記憶能力；(2)改善阿爾茨默氏癥(Alzheimer’S?Disease)；(3)治療抑郁癥；(4)緩解精神壓力和身體疲勞。

目前工業化生產磷脂酰絲氨酸的主流方法是采用浸提法，存在選擇性不高、易引入其他雜質、無法獲取純的磷脂酰絲氨酸等問題；而化學合成法生產磷脂酰絲氨酸也不能達到實際生產要求。利用磷脂酰絲氨酸合成酶的高度專一性，催化卵磷脂和絲氨酸制備磷脂酰絲氨酸，有望改變目前在生產磷脂酰絲氨酸上存在的問題，為工業化定向生產高純度磷脂類物質奠定基礎。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種選擇性高，最終產物雜質少、純度高的磷脂酰絲氨酸合成酶催化合成磷脂酰絲氨酸的方法。

本發明是通過以下技術方案來實現的：

一種磷脂酰絲氨酸合成酶催化合成磷脂酰絲氨酸的方法，包括以下步驟：

(1).將磷脂酰絲氨酸合成酶酶液加入含有絲氨酸、CaCl₂、Triton-X100的醋酸緩沖液中，然后與含有卵磷脂的氯仿溶液混合，在28～32℃條件下磁力攪拌反應3～5小時；

(2).反應結束后雙液相自然分層，提取有機相備用；

(3).有機相自然揮發后，剩余物經氯仿洗滌得到磷脂酰絲氨酸。

而且，所述的磷脂酰絲氨酸合成酶酶液與醋酸緩沖液的體積比為1∶50。

而且，所述的步驟(1)中的絲氨酸的濃度為3.4M。

而且，所述的步驟(1)中的CaCl₂的濃度為20mM。

而且，所述的步驟(1)中的Triton-X100的濃度為0.375％。

而且，所述的步驟(1)中的醋酸緩沖液的pH為7.0。

而且，所述的步驟(1)中的卵磷脂的濃度為17.0mM。

而且，所述的步驟(1)中的醋酸緩沖液與氯仿溶液的體積比為1∶1。

本發明的有益效果和優點：