[發明專利]CEA正調控IL-15腫瘤免疫基因治療質粒載體及應用

無效

• 申請號: 200810053549.1
• 申請日: 2008-06-18
• 公開（公告）號: CN101586114A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 何向輝;李衛東;朱理瑋
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學總醫院
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/24;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司
• 代理人: 侯 力

【技術領域】：

本發明屬于基因工程領域，具體涉及癌胚抗原(CEA)陽性腫瘤的免疫基因治療載體的構建和應用。

【背景技術】：

基因治療是近十幾年來隨著現代分子生物學技術的發展而誕生的新的生物醫學治療技術。基因治療是通過特定載體將具有治療作用的基因導入細胞的治療方法。基因治療載體包括病毒載體和非病毒載體。質粒載體是非病毒載體的一種，具有制備簡單，易儲存，安全的特點，但質粒載體的體內基因表達效率轉染效率低，靶向性差，為其缺點。

細胞因子免疫基因治療是基因治療的重要策略之一，在腫瘤治療的研究中受到廣泛重視。細胞因子基因轉導可對腫瘤微環境產生影響，比單純給予外源性細胞因子治療的不良反應小，并可以在細胞局部持續性表達高濃度的細胞因子，刺激或增強機體的特異性抗腫瘤免疫反應，使腫瘤生長受到抑制，達到腫瘤治療的目的。多種細胞因子，包括IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-24，IL-27，IFN，TNFα等都已應用于腫瘤治療的臨床前實驗研究，其中IL-2，IL-12，IL-21，IFN，TNFα等已進行了臨床試驗研究。動物實驗結果表明多種細胞因子可以增強抗腫瘤免疫反應而抑制腫瘤生長，但臨床試驗中的效果還不理想。質粒載體體內基因表達效率低和靶向性差的缺點是影響其臨床效果的因素之一。大多數細胞因子表達載體使用CMV啟動子調控目的基因的表達，CMV啟動子也被認為是目前表達效率最高的啟動子之一，但CMV啟動子在體內易被滅活，使其效率降低，同時其調控的基因表達無組織特異性，限制了應用。

癌胚抗原(carcinoembryonic?antigen，CEA)是最早被發現和鑒定的腫瘤相關抗原之一，90％左右的消化道惡性腫瘤表現為CEA陽性。CEA在腫瘤細胞的表達受特異性調控序列-CEA啟動子的調控。CEA啟動子在某些腫瘤細胞，尤其是結直腸癌細胞中具有良好的特異性，因此，通過CEA啟動子調控目的基因在消化道腫瘤中靶向性表達成為可能，但CEA啟動子的活性較弱，其直接調控治療基因表達難以使外源性治療基因、尤其是細胞因子的表達達到治療水平。

【發明內容】：

本發明目的是克服現有技術存在的上述不足，提供一種CEA正調控IL-15腫瘤免疫基因治療質粒載體、構建方法及應用。實現細胞因子基因在CEA陽性細胞中的高效表達，以達到對CEA陽性腫瘤靶向免疫基因治療的目標。

本發明構建了一種以白細胞介素-15(Interleukin-15，IL-15)為治療基因、CEA啟動子正調控IL-15基因高效表達、對CEA陽性腫瘤靶向免疫基因治療的質粒載體。

本發明提供的CEA正調控IL-15腫瘤免疫基因治療質粒載體，具有序列表中序列1所示的基因序列。可應用在人腫瘤免疫基因的治療中。用于人腫瘤免疫基因的治療藥物的開發。

本發明的質粒載體為pHi2-sIL15-CEA-TAT(圖1)，在該質粒中，HIV2啟動子控制IL-15基因表達，CEA啟動子控制HIV反式轉錄因子TAT表達，TAT表達作用于HIV啟動子，增加其效率，從而實現對IL-15表達的正調控。同時，該質粒中IL-15基因的信號肽被IL-2信號肽替代，更進一步以增加IL-15表達效率。

本發明以細胞因子IL-15作為治療基因。IL-15是一個多功能的細胞因子，對天然免疫和獲得性免疫反應都有重要的調節作用。IL-15可以促進中性粒細胞、巨噬細胞的活性，對樹突狀細胞的功能起關鍵作用。另外，IL-15促進淋巴效應細胞，尤其是NK細胞、NKT細胞和CD8+T細胞的產生、激活、歸巢和存活。IL-15可以抑制IL-2誘導激活引起的細胞死亡。IL-15對記憶性T細胞的存活和增值起關鍵作用，其可以調節記憶性T細胞的穩態增值，維持其數量。因此，IL-15被認為是非常有潛力的可用于免疫治療的細胞因子。實驗證明應用IL-15可以促進過繼性轉移的腫瘤特異性T細胞的存活并增強對腫瘤的排斥，通過基因工程方法表達IL-15的腫瘤細胞在體內生長緩慢、轉移能力下降。最新資料證明IL-15可以使處于免疫耐受狀態的CD8⁺T細胞重新增值并恢復免疫功能。本發明中所用IL-15基因購自Invitrogen。

本發明以CEA啟動子驅動反式轉錄因子TAT的表達，再通過TAT增強HIV啟動子活力，從而間接實現CEA啟動子對HIV啟動子所驅動的目的基因的正調控。