[發明專利]一種人胱硫醚β－合成酶重組蛋白及應用

無效

• 申請號: 200810053282.6
• 申請日: 2008-05-28
• 公開（公告）號: CN101322840A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發明（設計）人: 錢令嘉;冷雪;趙云;杲修杰
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: A61K38/43
• 分類號: A61K38/43;C12N15/52;C12N15/70;C12N9/00;A61P3/10;A61P9/00
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技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及一種重組人胱硫醚β-合成酶(rhCBS)原核高效表 達技術及重組蛋白在制備用于防治心血管疾病的藥物應用，通過對完整的人CBS?cDNA 進行克隆，獨立構建人CBS的原核表達體系，并表達出具有野生活性的重組CBS蛋白， 利用心血管細胞體外培養模型和大鼠高同型半胱氨酸血癥模型確定重組CBS蛋白作為 藥物的治療作用。

背景技術

同型半胱氨酸是甲硫氨酸循環過程中一個代謝中間產物。近年來的研究已確認， 高同型半胱氨酸血癥與作為人類第一殺手的動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死等多種 心血管疾病的發生有密切關系，是心血管疾病的一個新的獨立的和重要的危險因素.對 高同型半胱血癥的有效抑制已成為心血管疾病防治的一個極為重要的醫學途徑。

HCY在體內存在兩種代謝途徑：重新甲基化合成甲硫氨酸，或通過轉硫途徑經胱硫 醚轉變為半胱氨酸。其間，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、胱硫醚β-合成酶及甲硫 氨酸合成酶(MS)是HCY代謝所必需的三個關鍵酶；這些酶活性減小或缺失，或者其 相應輔酶如：VitB₆，VitB₁₂和葉酸的缺乏，將導致HCY代謝異常，血漿濃度升高。研究 發現，CBS的轉硫途徑負責轉化體內46％的HCY，其對HCY的轉化能力是由MS和BHMT 所催化的兩個甲基化代謝途徑的近兩倍，CBS的基因表達和功能狀態對維持正常的HCY 血漿水平至關重要，CBS酶基因的部分缺失，或因營養原因導致輔酶缺失即可引起高同 型半胱氨酸血癥；cbs轉基因小鼠實驗表明，CBS的高表達則可以降低血漿HCY的水平。 然而，以目前人類遺傳性缺陷的發生率及基本營養狀況卻難以詮釋高同型半胱氨酸血 癥的高發病率，高同型半胱氨酸血癥患者的個體研究也表明，有相當比例的患者不存 在遺傳性缺陷和營養素缺乏的原因。高同型半胱氨酸血癥的病因學機制至今尚不清楚， 還難以從阻斷病因的途徑達到高同型半胱氨酸血癥致心血管功能的損傷作用及其發病 機制，有關高同型半胱氨酸血癥動物模型等未能有系統體系，而對高同型半胱氨酸血 癥的治療措施只是普遍采用外源性給予輔酶VitB₆、VitB₁₂和葉酸的方法以強化上述代 謝酶，但臨床效果多不理想。

CBS定位于胞漿，是由63kDa亞基(551個氨基酸)構成的同源四聚體。CBS是一個血紅 素蛋白，屬于吡哆醛磷酸(PLP)依賴酶中的B族。每個亞基與血紅素及PLP這兩個輔助因 子結合。人CBS包括一個血紅素結合區、一個高度保守的催化結構域和一個調節結構域。 血紅素結合于N-端前70個氨基酸殘基，該區域Cys52和His65為血紅素鐵離子的結合殘 基。研究表明，血紅素并不參與催化步驟，但其鐵離子的氧化還原狀態可影響全酶的催 化速率。高度保守的催化結構域位于第40～413氨基酸殘基，可形成45kDa的活性中心。 該區域Lys119殘基為PLP結合殘基，PLP是CBS催化反應所必需的依賴因子。C-端140個氨 基酸殘基構成的調節結構域對于人CBS四聚體的形成和酶的活化起重要的作用，它包含 所謂“CBS結構域″，該疏水性系列包含第415～468氨基酸殘基，它的功能尚不清楚。C- 端調節結構域包含一個S2腺苷蛋氨酸(adenosylmethionine，AdoMet)結合位點的自我 抑制區，其結合位點在氨基酸殘基第421～468處。AdoMet是蛋氨酸代謝過程中的重要調 節樞紐，它是CBS的變構激活劑，也是5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶 (5，10-methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)和甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉 移酶(betaine-homocys-teinemethyltransferase，BHMT)催化反應的變構抑制劑。