[發明專利]一種利用環介導等溫擴增技術檢測豚鼠氣單胞菌的試劑盒

無效

• 申請號: 200810052321.0
• 申請日: 2008-02-26
• 公開（公告）號: CN101235411A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 黃熙泰;魏曉娜;鄭澤軍
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用環介導等溫擴增技術檢測豚鼠氣單胞菌的試劑盒，其特征在于，它包括如下成分及各成分的作用濃度：

(1)特異性寡核苷酸引物：FIP、BIP、F3、B3、(各引物濃度均為5-15μmol/L)；

FIP：5’AGGCCCGCCGAGGCTGCGATTTTAGCGATAACAACGTTGA3’

BIP：5’AATAAAGCATGATTTTCGTTTTTCCGTGAGAAGGGCGGTGTC3’

F3：?5’AAGTTCGTTACCCAATGTAGAG3’

B3：?5’CCCTTCTACCGCCGTGCAAG3’

(2)DNA提取試劑：TE緩沖液(5-15mmol/L?Tris，0.5-1.5mmol/L?EDTA，pH?8.0)；蛋白酶K溶液(濃度10-20mg/mL，pH8.0)；Tris飽和酚(pH8.0)；乙酸鈉(濃度2-5mol/L)；乙醇(濃度95％)；

(3)PCR試劑管成分為：

10×反應緩沖液(200mmol/L?Tris-HCl(pH?8.8)，100mmol/L?KCl，100mmol/L(NH₄)₂SO₄，20mmol/L?MgSO₄，1％Triton?X-100)

(4)dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度為5-15mmol/L)；

(5)雙蒸水；

(6)BstDNA聚合酶(8u/μL)。

2.按照權利要求1所述的一種利用環介導等溫擴增技術檢測豚鼠氣單胞菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒檢測使用方法如下：

(1)DNA抽提

挑取待檢測菌落加入到0.4mL?TE緩沖液(pH8.0)中振蕩混勻。加蛋白酶K溶液10μL于55℃保溫1-2小時，加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強烈振蕩，8000轉/分離心3分鐘，取上清液，重復酚抽提；取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(3mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉/分離心5分鐘，棄上清，加70％冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉/分離心5分鐘，棄上清，加入50μLTE溶液，置-20℃保存；

(2)環介導等溫擴增(LAMP)

在PCR試劑管內加入下列試劑，使總體積為25μL：

PCR反應體系：

10×反應緩沖液???????(2.5μL)

(200mmol/L?Tris-HCl(pH?8.8)，100mmol/L?KCl，100mmol/L(NH₄)₂SO₄，20mmol/LMgSO₄，1％Triton?X-100)

Bst?DNA聚合酶????????8U(1μL)

FIP??????????????????40pmol(4μL)

BIP??????????????????40pmol(4μL)

F3???????????????????5pmol(0.5μL)

B3???????????????????5pmol(0.5μL)

dNTPs?????????每種80nmol/L(10mmol/L?0.5μL)

DNA樣品???????50ng(2μL)

雙蒸水????????10μL

LAMP擴增程序：

①將模板DNA?95℃變性5分鐘，立即插到冰上；

②62℃保持60分鐘；

③80℃保持2分鐘；

(3)電泳檢查

LAMP產物用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳后用溴化乙錠染色，電泳結果在紫外分析儀下觀察，陽性結果應是呈梯狀分布的條帶，且間距為160bp左右。