[發明專利]克倫特羅殘留的檢測方法

無效

• 申請號: 200810052284.3
• 申請日: 2008-02-14
• 公開（公告）號: CN101231293A
• 公開（公告）日: 2008-07-30
• 發明（設計）人: 高志賢;劉楠;蘇璞
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明涉及動物食品中藥物殘留的檢測方法，特別是涉及動物食品中克倫特羅殘留的檢測方法。

背景技術

近年來，食品的安全性已經成為社會共同關注的公共衛生問題，而獸藥殘留成為食品安全性的重要影響因素。國內市場調查發現肉品、乳制品的抗生素和激素殘留問題比較嚴重，近年來，各種動物性食品中克倫特羅(CLenbuterol，CL)的殘留問題已引起廣泛關注。克倫特羅俗稱“瘦肉精”，CL是一種作用極強的β₂受體激動劑，屬于腎上腺素的類激素，濫用會導致心率加速，肌肉震顫，代謝紊亂；特別是對于高血壓、心臟病、甲亢、青光眼、前列腺肥大等疾病患者危險性更大，可能會加重病情，導致意外或死亡。國家明令禁止在飼料和飼料添加劑中添加該物質，但一些飼料和養殖企業仍然違禁使用，導致多起克倫特羅殘留引起的食物中毒事件發生。2001年我國浙江、廣東、陜西等省發生了多起克侖特羅豬肉食物中毒。對于動物食品中克侖特羅殘留的檢測，最新的國標(GB/T?5009.192-2003)和行業標準(NY/T?468-2006)多以色譜法、色質聯用和酶聯免疫法(ELISA)等為主，國外也多以這些方法為主。色-質聯用和色譜法雖然靈敏度高，但實驗室條件要求高，檢測方法復雜，費時費力，成本高，在實際中較難滿足現場應用；ELISA法穩定性和重復性較差，檢測范圍窄，假陽性率高。因此，這些方法不能滿足當今快速靈敏準確的檢測需要。

懸浮芯片技術是美國Luminex公司開發的一種多功能的液相芯片分析平臺，它和傳統意義上的固相芯片有所不同。該系統的檢測載體為兩種被染上不同熒光染料的聚苯乙烯微球，每種微球上根據熒光染料的不同被定義上一個唯一的編碼地址；同時微球上固定有針對不同靶標物的探針，如果液相中存在有該檢測物，則可以被微球所捕獲。結合后，懸浮芯片系統采用2種激光進行檢測，紅色激光可定位微球的編碼地址，從而將各個不同的分析反應區別出來；綠色激光激發的是熒光報告分子鏈霉親和素-R-藻紅蛋白(Srtreptavidin-PE，SA-PE)，確定微球上結合的報告熒光分子的數量。由于熒光報告分子是與靶分子通過共價鍵直接連接或間接連接，從而可以確定微球上結合靶分子的量來測得靶標物的濃度。液相環境中更有利于保持生物活性物質的天然構象和活性，有利于探針和被檢測物的反應，在大多數的反應中不需要洗滌步驟，不會破壞反應的動態平衡，既具有固態片膜芯片高通量的特性，又具有優于它的操作簡便、重復性好、靈敏度高等優點；與固相芯片相比，液相芯片具有靈活性更好，可以根據需要調節每次檢測所需要的微球的數量和調整檢測體系的設計。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種操作簡單，靈敏快速，成本低廉的克倫特羅殘留的檢測方法。

本發明的技術方案概述如下：

(1)克倫特羅-小牛血清白蛋白偶聯物的制備、鑒定和生物素化；

(2)克倫特羅單克隆抗體在熒光微球上的偶聯；

(3)克倫特羅殘留的懸浮芯片檢測標準曲線的繪制；

(4)克倫特羅殘留的懸浮芯片檢測的特異度測定；

(5)待測樣品克倫特羅殘留濃度的測定。

優選的是步驟(1)克倫特羅-小牛血清白蛋白偶聯物的制備、鑒定和生物素化為：將克倫特羅標準品通過重氮化法與小牛血清白蛋白偶聯，獲得克倫特羅-小牛血清白蛋白偶聯物，通過紫外分光光度法進行鑒定；再將所述克倫特羅-小牛血清白蛋白偶聯物與生物素N-羥基丁二酰亞胺酯偶聯，得到克倫特羅-小牛血清白蛋白-生物素偶聯物。

所述步驟(2)克倫特羅單克隆抗體在熒光微球上的偶聯為：先將熒光微球用偶聯試劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺活化，然后將克倫特羅單克隆抗體通過氨基化反應偶聯于所述活化的熒光微球上，制成偶聯有克倫特羅單克隆抗體的熒光微球。

所述步驟(3)克倫特羅殘留的懸浮芯片檢測標準曲線的繪制為：將克倫特羅標準品按照5×梯度用水稀釋成7個梯度，在預先潤濕的Millipore96孔滲濾板的反應孔中分別加入100ng的克倫特羅-小牛血清白蛋白-生物素偶聯物和所述7種梯度不同的克倫特羅標準品，另設一陰性對照，使每孔中克倫特羅的終濃度達到50，250，1250，6250，31250，156250，781250pg/mL，再加入克倫特羅單克隆抗體的熒光微球反應1小時，向每孔加入適量鏈霉親和素-R-藻紅蛋白，37℃溫育半小時，懸浮芯片讀取500個微球，獲得中位熒光強度值，由配套軟件Bio-Manager4.0分析處理并繪制檢測標準曲線。