[發明專利]超濾法提取Ⅱ型真菌疏水蛋白的方法

有效

• 申請號: 200810052099.4
• 申請日: 2008-01-18
• 公開（公告）號: CN101215321A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 喬明強;王澤方;馮樹人;黃渝健;徐海津;張強;馮輝
• 申請（專利權）人: 喬明強
• 主分類號: C07K1/34
• 分類號: C07K1/34
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司
• 代理人: 侯力

【技術領域】：本發明屬于生物材料技術領域，特別涉及一種II型疏水蛋白的純化方法，即用超濾法純化II型疏水蛋白。該疏水蛋白可以應用到生物傳感器、細胞固定化、化妝品、醫藥衛生和乳化等的眾多領域。

【背景技術】：疏水蛋白(hydrophobin)是高等絲狀真菌在特定發育階段大量分泌的一類具有特殊性質的小型結構蛋白，它們能夠在不同界面處自組裝成為一種兩親性薄膜。這種特性在很多方面都得到了應用，涉及到生物傳感器、細胞固定化、化妝品、醫藥衛生和乳化等的眾多領域。

由于疏水蛋白的特殊性質，疏水蛋白的純化與一般蛋白相比，難度比較大。根據疏水性圖譜及裝配成的兩性蛋白膜的溶解性等特征，疏水蛋白可以分為兩類：I型和II型，并且因為兩者的性質差別很大，因而提取方法差別也很大。據已公開的文獻來看，疏水蛋白的主要純化方法如下：

(1)三氟乙酸法：如SC3、SC4、EAS、HYPA等I型疏水蛋白就是利用此法提取純化。這種方法利用了I型疏水蛋白在界面形成的聚合物(包括菌絲和孢子的表面)不能在熱SDS溶液中解聚和溶解，而只能在強酸如過氧甲酸(PFA)和三氟乙酸(TFA)中解聚成單體(早期用PFA，后期都用TFA)的特性。

(2)唯一的一種溫和條件下提取I型疏水蛋白的方法：1998年Lora?JM等發現裂褶菌分泌SC3的同時分泌高分子量的多糖裂褶菌素，裂褶菌素在水溶液能穩定SC3，以此發明了用疏水層析法從發酵清液中分離I型疏水蛋白的方法。除此之外，對I型疏水蛋白還沒有提出TFA(或PFA)解聚以外的分離純化方法。

(3)II型疏水蛋白純化法：因為II型疏水蛋白能被1％～2％SDS溶液和60％乙醇溶液解聚和溶解，所以如CU、CFTH1以及融合蛋白EGIcore-HFBI等一般都不用PFA或TFA解聚，而用近幾年發展起來SDS抽提法、雙水相系統ATPS分離法和各種層析法分離純化。但SDS抽提法和雙水相系統ATPS分離法需要使用大量的無機或有機試劑，分離后產生的廢液還需額外處理，并且最后所得II型蛋白溶液含有大量鹽類和色素，還需要下一步工藝來去除它們；各種層析方法雖然能有效的解決最終II型疏水蛋白溶液中含有鹽類和色素的問題但實際應用中能處理蛋白粗樣品的規模太小，并且各種層析所用填料價格昂貴，不適合于大規模使用。

超濾(UF)以壓力為推動力，利用中空纖維超濾膜不同孔徑對液體進行分離的物理篩分過程，其切割分子量(CWCO)10³至10⁶，孔徑1100nm。1965年，首先由美國亞米康公司開發成功中空纖維式超濾器，并投放市場。超濾應用范圍很廣，除在水處理工程中，用于除菌、膠體和大分子有機物等外，還可以用于許多特殊溶液的分離、精制，如血液凈化、蛋白質精制、大分子有機物與鹽的分離和脫水等。超濾作為一種較為快速簡便的方法，具有對產物破壞少的優點。中空纖維超濾膜由于孔徑小，過濾時不易產生濃差極化，并具有可同時脫鹽和濃縮等優點，故被國內外一些研究者相繼采用，用于蛋白質的濃縮和沉淀劑去除。

但是到目前為止，市場上還沒有一種成型的疏水蛋白產品，主要是因為現有的疏水蛋白的純化方法過程復雜，成本過高，不適合在大規模工業生產上應用。

【發明內容】：本發明目的是解決現有技術存在的不足，提供一種適合在大規模工業生產上應用的超濾法提取II型疏水蛋白的方法。以便去除II型疏水蛋白粗提液中的大部分色素，無機鹽以及其它小分子物質，得到高純度的疏水蛋白。

本發明提供的超濾法提取II型真菌疏水蛋白的方法，包括以下步驟：

第一、用SDS法從真菌菌絲表面抽提II型真菌疏水蛋白，經離心或板框過濾得到蛋白粗提液；

第二、用KCl對蛋白粗提液進行處理，經離心，板框或微濾以除去II型真菌疏水蛋白粗提液中70％-80％左右的SDS；

第三、超濾，將KCl處理后的II型真菌疏水蛋白粗提液通過膜孔徑為3000-10000的中空纖維超濾膜，經過超濾得到II型真菌疏水蛋白濃縮液；超濾結束后對超濾膜進行反洗，待用。

對上述第三步得到II型真菌疏水蛋白濃縮液，可以進行常規噴霧干燥，得到含量在20％-30％的II型真菌疏水蛋白干粉。

其中，超濾過程中所用的中空纖維超濾膜材質為聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈或聚偏氟乙烯；中空纖維超濾膜為卷式膜或管式膜。

超濾運行工藝條件為：運行壓力0.02-0.09MPa；運行溫度為20-45℃；運行PH為3-11；每超濾2小時需要反洗。