[發明專利]單條植物線蟲核糖體內部轉錄間隔區序列套式PCR擴增方法

無效

• 申請號: 200810052041.X
• 申請日: 2008-01-10
• 公開（公告）號: CN101230343A
• 公開（公告）日: 2008-07-30
• 發明（設計）人: 王金成;黃國明;郭京澤;楊秀麗;劉鵬
• 申請（專利權）人: 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/30;C12Q1/04
• 代理公司: 天津市鼎和專利商標代理有限公司
• 代理人: 李鳳

技術領域

本發明屬于植物寄生線蟲檢測領域，特別是用套式PCR技術擴增單條植物寄生線蟲核糖體18S?rDNA和28S?rDNA轉錄間隔區(Internal?Transcribed?Spacer，ITS)的核酸序列的方法。

背景技術

Poinar(1983)估計地球上有線蟲約50萬種，已知種類約15,000種，其中約有10％是植物線蟲。目前世界上已記載的植物線蟲約有200多屬5000多種(謝輝，2005，植物線蟲分類學，第二版，北京：高等教育出版社)。2007年農業部862號文件公布的中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄中，植物寄生線蟲有20個屬/種，約160種。

據2000年的統計，全世界因線蟲危害給糧食和纖維作物造成的損失約為12.7％，對蔬菜、花生、煙草和某些果樹造成的損失超過20％。因此，線蟲已成為植物的一類重要的病原生物，線蟲病害已成為農林生產上的重要問題(劉維志，2004，植物線蟲志，北京：中國農業出版社)。

植物線蟲危害如此嚴重，但是由于種類繁多，所以植保工作者要想對線蟲進行快速準確的鑒定非常困難，對于基層、口岸等經驗不足、水平不高的工作人員尤其如此，從而進一步阻礙了農業防治措施的運用或檢疫處理措施的實施。

ITS(ITS1和ITS2)區是一段高度重復且具有較高進化速率的核酸序列，位于核糖體rDNA的18S?rDNA和28S?rDNA之間，其側翼片段均為保守序列，所以利用線蟲ITS區通用引物可以對多種線蟲的ITS區進行PCR擴增和測序等分析，作為線蟲分類的分子標記(Powers?TO，Todd?T?C，Burnell?A?M，et?al.1?997.T小時e?rDNA?internal?transcribed?spacer?region?as?ataxonomic?maker?for?nematodes.Nematology，29：441～450)。

1998年以來，南京農大植物線蟲實驗室、天津出入境檢驗檢疫局植物檢疫實驗室與德國聯邦農林研究所(BBA)一直保持密切的聯系與合作，通過近10年的努力已經基本解決了該技術需要的相關關鍵技術：

1.已經成功的建立了單條植物線蟲DNA微量提取技術(WANG?Jin-C小時eng，YU?Ben-Yuan，LIN?Mao-Song，2005.Description?of?a?new?species(Nematoda，ap小時elenc小時oididae)isolated?from?wood?packaging?material.Acta?Zootaxonomica，30(2)：314～319)。

2.通過多年研究，基本鎖定目標片斷為核糖體rDNA的轉錄間隔區序列ITS，并建立了傘滑刃屬、粒屬、莖屬、類短體屬、短體屬、矮化屬、根結屬等線蟲的rDNA-ITS序列的常規PCR或套式PCR擴增體系。

3.限制性內切酶組合的選擇采用Webcutter2.0與實驗相結合的方法進行，更加快速、便捷。

發明內容

根據植物線蟲檢測中現有技術的檢測難度和我們的實驗基礎，本發明建立了單條植物寄生線蟲核糖體ITS核酸序列套式PCR擴增技術體系，該項技術是單條植物寄生線蟲核糖體ITS核酸序列常規PCR擴增技術的補充。

目前，本發明技術已經在植物寄生線蟲中的根結線蟲幼蟲和短體線蟲ITS區序列的擴增上應用并獲得了成功，效果顯著。本發明技術是構建Nema-log植物線蟲分子標記系統的關鍵共性技術(王金成，黃國明，劉鵬，2007，關于構建Nema-log植物線蟲分子標記系統的設想，未發表文章)，它解決了植物寄生線蟲單條幼蟲以及難于擴增的線蟲種類ITS區序列的難題。

本發明的具體技術方案如下：

本發明目的是提供一種用于單條植物寄生線蟲核糖體ITS核酸序列套式PCR擴增技術，是構建Nema-log植物線蟲分子標記系統的關鍵共性技術，它包括以下步驟：

1.單條植物寄生線蟲總DNA的提取。

2.篩選的引物序列如下：

P1：5’-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3’

P2：5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’

P3：5’-GATTACGTCCCTGCCCTTTGT-3’

3.單條植物寄生線蟲核糖體ITS核酸序列套式PCR第一步的擴增。

4.單條植物寄生線蟲核糖體ITS核酸序列套式PCR第二步的擴增。

本發明可以在檢測植物寄生線蟲方面廣泛應用。