[發(fā)明專利]一種安全的植物抗逆表達(dá)載體及在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810051566.1
• 申請(qǐng)日: 2008-12-10
• 公開（公告）號(hào): CN101423844A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邢少辰;韋正乙;劉艷芝;林春晶;蔡勤安;郭喜英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/29;C12N15/61;C12N1/21;A01H1/00;C12R1/19
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 陳宏偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明構(gòu)建了一種安全的植物抗逆表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)含有目的基因(DREB2A)的該載體在百脈根中的抗旱性表達(dá)。本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

自從1983年世界上誕生第一例轉(zhuǎn)基因植株以來(lái)，轉(zhuǎn)基因作物的安全性曾經(jīng)在全球范圍引起很大爭(zhēng)議，一個(gè)主要的原因是在轉(zhuǎn)基因操作過程中的初期，為了篩選含有目的基因的細(xì)胞的需要，用于植物表達(dá)的載體往往含有抗生素基因和除草劑基因，而當(dāng)篩選得到目的細(xì)胞后，抗生素基因就沒有用途了，但它在轉(zhuǎn)基因材料中的存在會(huì)帶來(lái)環(huán)境和食品上的安全隱患。因此，近些年來(lái)植物轉(zhuǎn)基因研究的熱點(diǎn)之一就是實(shí)現(xiàn)安全性標(biāo)記，其中糖代謝相關(guān)基因研究得最多也最深入，木糖異構(gòu)酶(xylose?isomerase，XI)基因(XylA)是這類選擇標(biāo)記之一。大腸桿菌XylA基因編碼的木糖異構(gòu)酶能夠催化木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟就牵瑥亩簧矬w利用。

多數(shù)植物并不能利用木糖的原因在于其體內(nèi)缺乏木糖異構(gòu)酶，因而木糖異構(gòu)酶可以用來(lái)作為植物轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記，其原理是木糖在XylA的催化下能轉(zhuǎn)變成木酮糖(xylulose)，再經(jīng)過磷酸戊糖途徑分解代謝，最終為細(xì)胞生長(zhǎng)所利用。在以木糖為唯一碳源或者主要碳源的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化細(xì)胞因能利用木糖而呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則因碳源供應(yīng)不足而使生長(zhǎng)受到抑制。該酶廣泛分布于動(dòng)物和部分植物體內(nèi)，并且廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，用于生產(chǎn)果糖或高果糖漿，因而不會(huì)對(duì)人類和動(dòng)物的健康帶來(lái)威脅，事實(shí)上動(dòng)物體內(nèi)也都能合成木糖異構(gòu)酶。

植物通過一些特定基因的表達(dá)來(lái)應(yīng)答干旱、高鹽和低溫脅迫等逆境脅迫，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物可以分為兩類：一類是起直接保護(hù)細(xì)胞免受水分脅迫作用的物質(zhì)，包括相關(guān)功能蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子的合成酶、解毒物質(zhì)等；另一類主要是起調(diào)節(jié)作用，并不直接參與保護(hù)，包括傳遞信號(hào)和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、感應(yīng)和傳導(dǎo)脅迫信號(hào)的蛋白激酶等。

然而，目前的抗逆轉(zhuǎn)基因研究中，主要是將相關(guān)的單一基因(即編碼上述第一類產(chǎn)物的基因)直接轉(zhuǎn)到植物中，得到的轉(zhuǎn)基因植物時(shí)常不能獲得預(yù)期的抗性，主要是因?yàn)閷?duì)干旱、鹽堿的應(yīng)答反應(yīng)并不是一兩個(gè)基因的表達(dá)所能完成的，相反，在大多數(shù)情況下是多基因協(xié)同作用的結(jié)果。因而，轉(zhuǎn)入具有多重作用的轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因被認(rèn)為是一種更為有效的方法。例如，轉(zhuǎn)入DREB類轉(zhuǎn)錄因子(DREB2A基因是其中之一)的擬南芥、水稻、油菜、煙草、番茄等植物體內(nèi)的游離脯氨酸含量提高，植物的抗逆性明顯增強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開一種安全的植物抗逆表達(dá)載體，目的是為培育環(huán)境安全、抗逆性優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因植物提供一種有效的表達(dá)載體。用該載體轉(zhuǎn)化植物，可以避免使用抗生素和除草劑，篩選獲得高抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明的安全性植物抗逆表達(dá)載體，其特征是：

以木糖異構(gòu)酶基因XylA為篩選標(biāo)記、啟動(dòng)子為物理因素誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子rd29A，目的基因是抗逆性轉(zhuǎn)錄因子DREB2A。

本發(fā)明的安全性植物抗逆表達(dá)載體是用木糖異構(gòu)酶基因XylA及其所帶rd29A啟動(dòng)子替換了基礎(chǔ)載體pCAMBIA3301的標(biāo)記基因潮霉素抗性基因及其啟動(dòng)子，抗逆性轉(zhuǎn)錄因子基因DREB2A編碼序列替換了報(bào)告基因Gus的編碼序列而構(gòu)建成的。這兩基因位于載體T-DNA左邊界LB和右邊界RB序列之間。其中，XylA基因表達(dá)框結(jié)構(gòu)是：從5′到3′端方向依次為(I)CaMV35S啟動(dòng)子，(II)TMVRNA的Ω片斷，(III)木糖異構(gòu)酶基因XylA編碼序列，(IV)CaMV35S?Poly-A序列；DREB2A基因表達(dá)框機(jī)構(gòu)是：從5′到3′端方向依次為(I)CaMV35S啟動(dòng)子，(II)抗逆轉(zhuǎn)錄因子DREB2A編碼序列，(III)Nos?Poly-A序列。

本載體中的啟動(dòng)子是rd29A，這個(gè)啟動(dòng)子克隆自擬南芥，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在高鹽、高滲和ABA誘導(dǎo)下均能表達(dá)，且其表達(dá)量不低于組成型的35S啟動(dòng)子。另外，在不存在誘導(dǎo)條件下有非常微弱的表達(dá)，屬于正常，因?yàn)樵跀M南芥中，rd29A基因有很微量的組成型表達(dá)，將含有這類應(yīng)答元件的啟動(dòng)子，連接上感興趣的基因，便能組成一個(gè)分子開關(guān)系統(tǒng)。把這樣的分子開關(guān)系統(tǒng)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物中，就可以讓目標(biāo)基因在植物體受到干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫或者有外源ABA誘導(dǎo)的時(shí)候才表達(dá)。目前，該分子開關(guān)系統(tǒng)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。

本發(fā)明的安全性植物抗逆表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得含有該載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。