[發(fā)明專(zhuān)利]在豌豆中瞬時(shí)表達(dá)外源蛋白的發(fā)芽種子真空侵染法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810051444.2
• 申請(qǐng)日: 2008-11-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101457236A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王興智;朱筱娟;范亞軍;李偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 東北師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/83
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/83;C12N15/12;C07K14/50
• 代理公司: 長(zhǎng)春市東師專(zhuān)利事務(wù)所
• 代理人: 劉延軍;李榮武

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及在豌豆中瞬時(shí)表達(dá)外源蛋白的發(fā)芽種子真空侵染法。

背景技術(shù)

近年來(lái)以植物作為生物反應(yīng)器瞬時(shí)表達(dá)外源蛋白以其周期短、易操作和低成本等優(yōu)點(diǎn)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。到目前為止利用植物瞬時(shí)表達(dá)體系的主要方法有葉片直接涂抹法、葉片真空侵染法和葉片注射法三種。其中直接涂抹法和葉片注射法需要逐個(gè)葉片操作耗時(shí)比較長(zhǎng)；葉片真空侵染法主要是在離體葉片上進(jìn)行，外源蛋白的表達(dá)只能限定在被侵染的葉片上，而且真空侵染后需要后續(xù)的工作來(lái)維持葉片的新鮮度。

作為生物反應(yīng)器瞬時(shí)表達(dá)體系的植物有很多種，包括煙草、西紅柿、黃瓜、水稻和生菜等。其中以茄科植物作為生物反應(yīng)器的研究居多，但茄科植物體中含有煙堿，在后期蛋白純化過(guò)程中可能污染目的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一個(gè)方便、快捷可以在豌豆中大量瞬時(shí)表達(dá)外源蛋白方法。

本發(fā)明的具體方案如下：

1.以綠色熒光蛋白GFP為報(bào)告基因建立和優(yōu)化發(fā)芽種子真空侵染瞬時(shí)表達(dá)體系。

首先將豌豆早褐病毒載體pCAPE1和pCAPE2-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，挑取經(jīng)轉(zhuǎn)化和鑒定的農(nóng)桿菌GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1單菌落，分別接種于LB液體培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，離心收集菌體，菌體沉淀用無(wú)菌水溶液重懸，將GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1兩種菌體的重懸液混合后侵染根長(zhǎng)2-3厘米的豌豆發(fā)芽種子，侵染后將種子播種于土壤中，8-20天在紫外燈下觀察豌豆植株中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況以確定侵染條件。選擇適當(dāng)?shù)恼婵諌毫?、真空時(shí)間、菌液濃度和傷害處理四個(gè)因子進(jìn)行體系的優(yōu)化，在無(wú)傷害處理?xiàng)l件下，重懸液濃度OD₆₀₀＝1.0-1.2，真空壓力為0.06-0.1MPa，真空時(shí)間為1-15分鐘，于侵染后12-14天收獲外源蛋白。

2.以發(fā)芽種子真空侵染法在豌豆中瞬時(shí)表達(dá)人源酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

將編碼人源酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子DNA序列連入豌豆早褐病毒表達(dá)載體pCAPE2中構(gòu)建得到pCAPE2-aFGF，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，挑取經(jīng)鑒定的農(nóng)桿菌GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPE1單菌落，分別接種于LB液體培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，離心收集菌體，菌體沉淀用無(wú)菌水溶液重懸，將GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPE1兩種菌體的重懸液混合后侵染根長(zhǎng)2-3厘米的豌豆發(fā)芽種子，在無(wú)傷害處理?xiàng)l件下，侵染時(shí)重懸液濃度OD₆₀₀＝1.0-1.2，真空壓力為0.06-0.1MPa，真空時(shí)間為1-15分鐘，侵染后將種子播種于土壤中，并以1中以綠色熒光蛋白GFP為報(bào)告基因建立和優(yōu)化發(fā)芽種子真空侵染瞬時(shí)表達(dá)體系為參照依據(jù)，于侵染后12-14天收獲外源蛋白。并以Western?blot檢測(cè)外源蛋白人源酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。

豆科植物是非常重要的經(jīng)濟(jì)作物，多數(shù)的豆科植物蛋白質(zhì)含量比較高，而且很多豆科植物都是非常優(yōu)質(zhì)的牧草，因此以豆科植物作為生物反應(yīng)器具有重要意義。本發(fā)明周期短、易操作、成本低、無(wú)污染，可以方便、快捷在豌豆中大量瞬時(shí)表達(dá)外源蛋白。

具體實(shí)施方案

本發(fā)明的實(shí)施例包括以下內(nèi)容：

1.以綠色熒光蛋白GFP為報(bào)告基因構(gòu)建并優(yōu)化豌豆發(fā)芽種子真空瞬時(shí)表達(dá)外源蛋白體系