[發明專利]煙草野火病病原菌hrpZ基因及其表達產物與應用

無效

• 申請號: 200810051365.1
• 申請日: 2008-10-31
• 公開（公告）號: CN101386859A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發明（設計）人: 姜兆遠;高潔;張佳環
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/10;C12N15/70;C07K14/21;A01N63/02;A01P3/00;A01P17/00;A01P21/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 魏征驥

1、一種煙草野火病病原菌hrpZ_Psta基因，其特征在于：該基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所述。

2、如權利要求1所述的煙草野火病病原菌hrpZ_Psta基因在調節植物生長發育和使植物獲得廣譜抗病蟲性方面的應用。

3、如權利要求1所述的煙草野火病病原菌hrpZ_Psta基因的克隆方法，包括下列步驟：

(1)提取煙草野火病病原菌(Pseudomonas?syringae?pv.tabaci)的基因組DNA，根據Genebank中登錄號為AB112555的hrpZ序列，設計完整開放閱讀框(ORF)引物：

hrpZ-P1：5′-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC；

hrpZ-P2：5′-TCACCATTGGAATTGCTGTTG。

(2)以煙草野火病病原菌(Pseudomonas?syringae?pv.tabaci)的基因組DNA為模板進行PCR擴增；反應條件為94℃變性4min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸35s，循環35次，72℃延伸10min，4℃保存；

(3)將PCR產物與PTA2載體連接得PTA2-hrpZ重組體，轉化到大腸桿菌菌株top10中，經PCR及酶切鑒定得陽性轉化子；

(4)提取陽性重組質粒pTA2-hrpZ的DNA并測序。

4、如權利要求1所述的煙草野火病病原菌hrpZ_Psta基因的表達方法，包括下列步驟：

(1)根據所得的hrpZ基因的開放閱讀框(ORF)，設計擴增ORF(剔除起始密碼子)的引物P3和P4，在5′端分別引入BamH1和EcoR1酶切位點：

hrpZ-P3：5′-GGGGATCCCAGAGTCTCAGTCTTAAC(BamH1)；

hrpZ-P4：5′-GGGAATTCTCACCATTGGAATTGCTG(EcoR1)；

以陽性重組質粒pTA2-hrpZ為模板，PCR擴增，產物經BamH1和EcoR1雙酶切處理，插入到載體PGEX-4T-1的BamH1和EcoR1酶切位點之間，使得hrpZ_psta基因與PGEX-4T-1上的還原型谷胱甘肽標簽形成融合基因，從而得到原核表達質粒PGEX-hrpZ_psta；

(2)表達質粒轉入到大腸桿菌BL21(DE3)中，在LB培養基(Amp100ug/mL)中37℃振搖(120～250r/min)培養至OD₆₀₀＝0.5～0.8，取400～500ul接種于30ml?LB表達培養基(Amp100ug/mL)中培養2～3h后加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續培養3～5h。取誘導的菌液1.5ml于1.5ml的離心管中離心1min，去除上清，將沉淀加入50ul?2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min，取30ul進行SDS-PAGE，檢測目的蛋白的表達情況。

5、如權利要求1所述煙草野火病病原菌hrpZ_Psta基因編碼的Harpin蛋白質，其特征在于：該蛋白質的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所述。

6、煙草野火病病原菌hrpZ_Psta基因編碼的Harpin蛋白質在調節植物生長發育和使植物獲得廣譜抗病蟲性方面的應用。