[發明專利]p21啟動子去乙酰化酶抑制劑篩選模型的構建及其應用

無效

• 申請號: 200810050709.7
• 申請日: 2008-05-16
• 公開（公告）號: CN101275157A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 陸軍;黃百渠
• 申請（專利權）人: 東北師范大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12Q1/66;C12N5/10
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明公開了一種p21啟動子去乙酰化酶抑制劑篩選模型，同時還提供了應用此模型篩選組蛋白去乙酰化酶抑制劑的方法，屬于生物醫藥技術領域。

背景技術

目前的研究表明，組蛋白乙酰化酶(histone?acetyltransferases，簡稱：HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone?deacetylases，簡稱：HDACs)可以通過調節組蛋白或轉錄因子的乙酰化狀態來調節基因的活化或沉默。HATs引發染色質結構的松散，激活轉錄；而HDACs則可導致染色質集縮，并抑制特定靶基因的轉錄。細胞及有機體內組蛋白的乙酰化和去乙酰化之間存在著一種平衡，這種平衡是受到嚴格控制的，并通過對相關基因表達的調控來決定細胞的命運，平衡的打破成為產生某些癌癥的直接誘因。越來越多的證據表明在組蛋白乙酰化的失衡與癌癥發生之間存在著密切的聯系。這些可逆失活的基因的重新表達可抑制腫瘤的生長。目前發現組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDAC?inhibitors，簡稱：HDI)能夠逆轉某些基因的失活，有望成為腫瘤治療的新型藥物。其中丁酸、SAHA、MS-275、CI-994、2-丙基戊酸(valproic?acid)、proxamide和縮肽(depsipeptide)等幾種組蛋白去乙酰化酶抑制劑在國外已經進入I期和II期臨床。

另外，越來越多的證據顯示，HDI與化療，放療和免疫治療等手段相結合后，可以顯著提高這些癌癥治療方法的療效。

p21^WAF1基因編碼的蛋白是一種細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子(CDKI)，在細胞周期的調控、細胞的凋亡和細胞的分化中都起著重要的作用。研究表明，p21^WAF1基因作為一種重要的抑癌基因，其表達量的多少與腫瘤密切相關。p21^WAF1基因的低表達，可造成異常細胞增生和腫瘤的形成。在乳腺癌、結腸癌、卵巢癌等多種癌癥中，p21^WAF1基因的表達明顯降低。最近的研究表明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA、NaB、PB、SAHA、FK-228、MS-275和Oxamflatin等可以誘導p21^WAF1基因表達的增加，而且這種誘導主要發生在基因轉錄調節水平上。

發明內容

本發明公開了一種p21啟動子去乙酰化酶抑制劑篩選模型，用于組蛋白去乙酰化酶抑制劑的篩選。

本發明還提供了應用此模型篩選組蛋白去乙酰化酶抑制劑的方法，可簡便、靈敏、高效的篩選組蛋白去乙酰化酶抑制劑。

本發明提供的抑制劑篩選模型是克隆了p21^WAF1基因啟動子及與其相連的熒光素酶報告基因的穩定轉染的細胞株。

本發明的技術解決方案是提供一個組蛋白去乙酰化酶抑制劑篩系統，此篩選系統是一個含有p21^WAF1基因啟動子和熒光素酶報告基因，且包含Neo基因的重組載體的穩定轉染細胞株。

上述的篩選系統中，用于制備穩定轉染細胞株的受體細胞是哺乳類細胞，優選于HEK293、Jurkat或MCF-7細胞。

所述的篩選系統的制備方法，包括以下步驟：

1)將p21^WAF1基因啟動子與熒光素酶報告基因連接得到重組子質粒；

2)利用重組子質粒轉染宿主細胞形成穩定轉染細胞株；

本發明所述的熒光素酶報告基因是來自于Promega公司商業化的pGL3載體質粒。

本發明所述體外培養細胞優選的是人胚腎細胞HEK293、人T淋巴瘤細胞Jurkat、乳腺癌細胞MCF-7，當然，其它體外培養的哺乳類細胞也可以。

應用本發明篩選系統的篩選方法，將上述的穩定轉染細胞株與待測樣品接觸，檢測細胞內熒光素酶活性，選取上述相對熒光素酶活性(藥物組/對照組)大于2的藥物，利用HDAC?Fluorimetric?Assay/DrugDiscovery試劑盒(BIOMOL?International)測定其組蛋白去乙酰化酶抑制劑的活性。且組蛋白去乙酰化酶活性的抑制率達到50％以上的樣品，即為篩選得到的組蛋白去乙酰化酶抑制劑。

本發明的積極效果在于：篩選模型是基于多種組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以顯著提高p21^WAF1基因表達這一原理而設計的，組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA和NaB能夠顯著提高p21^WAF1基因啟動子熒光素酶報告基因的活性，用于組蛋白去乙酰化酶抑制劑的篩選，具有直接、快速、簡便等優點，既適合于手工篩選，又適合于大規模的抑制劑篩選。

附圖說明