[發(fā)明專利]一種基因組重排木霉菌及其制備及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810050619.8
• 申請(qǐng)日: 2008-04-18
• 公開（公告）號(hào): CN101260371A
• 公開（公告）日: 2008-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王丕武;張發(fā)福;付永平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/15
• 分類號(hào): C12N1/15;C12N13/00;C12N15/01;C12N15/04;C12N9/42;C12R1/885
• 代理公司: 吉林長春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 魏征驥

1.?一種基因組重排木霉菌，其在中國微生物菌種保臧管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC?No.2360。

2.?一種制備權(quán)利要求1所述基因組重排木霉菌株的方法，其包括如下步驟：

(一)將原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉，分別采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，挑取生長較旺盛的菌落進(jìn)行剛果紅培養(yǎng)基平板及固體發(fā)酵培養(yǎng)，測定纖維素酶活；

(二)基因組重排：

(1)原生質(zhì)體制備與再生：將純化后生長最旺盛產(chǎn)酶最高的綠色木霉AS3.3711和康寧木霉的孢子在水中稀釋至呈淺綠色，為(1～5)×10⁷個(gè)孢子·ml^-1，將孢子懸浮液1ml加入到盛有100ml液體菌絲培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶放到搖床中，振蕩培養(yǎng)，條件為：28-30℃，200r/min，20-24h，在無菌條件下，將無菌條件下培養(yǎng)的菌絲經(jīng)4層無菌擦鏡紙過濾，用無菌水沖洗兩次，再用高滲緩沖液清洗兩次，稱重后加入到50mL離心管中，將新配制好的酶液加入到50ml離心管中，加入量為菌絲重的2倍，29-32℃下振蕩培養(yǎng)180r/min，2-5h，用4層無菌擦鏡紙過濾除去菌絲碎片，收集濾液置于離心管中，3000r/min離心10min收集原生質(zhì)體，重新用該高滲緩沖液反復(fù)洗滌2～3次，用血球計(jì)數(shù)法確定原生質(zhì)體溶液的濃度，并調(diào)至10⁷個(gè)/ml；

(2)原生質(zhì)體初級(jí)誘變

將步驟(1)制備的原生質(zhì)體分別采用紫外線UV和甲基磺酸乙酯EMS兩種誘變方法進(jìn)行誘變處理，涂布到再生培養(yǎng)基上再生，然后將再生菌株通過剛果紅培養(yǎng)基平板和固體發(fā)酵試驗(yàn)，分別篩選得到經(jīng)紫外線誘變的產(chǎn)纖維素酶比原始菌株增加1％以上的多株突變菌株--Tv-UV及Tk-UV和經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變的產(chǎn)纖維素酶比原始菌株增加1％以上的多株突變菌株-Tv-EMS及Tk-EMS；

(3)多母本遞進(jìn)式原生質(zhì)體融合即基因組重排

將步驟(2)得到的紫外線-UV和甲基磺酸乙酯-EMS誘變菌株按照步驟(1)分別制備原生質(zhì)，并把各原生質(zhì)體等體積混合后均分為兩組，一組置于功率15W的紫外燈下處理5-20min，另一組置于60℃水浴中處理30-120min完全滅活后，混合后3000rpm離心5min，棄上清，加入30℃預(yù)熱的PEG融合液1ml，30℃保溫20min，4000rpm離心，用液體高滲緩沖液離心洗滌3次，并作適當(dāng)稀釋，取200ul涂布于再生培養(yǎng)基上，29℃培養(yǎng)5-7天觀察長出菌落。將菌落接種到剛果紅培養(yǎng)基平板培養(yǎng)測透明圈，挑取透明圈與菌落比較大的進(jìn)行固體發(fā)酵測定纖維素酶活。得到產(chǎn)酶量比原始菌株高2％的以上的突變菌株-T-F1；

將4個(gè)T-F1菌株繼續(xù)步驟(3)進(jìn)行下一輪的原生質(zhì)體制備、滅活、融合與剛果紅培養(yǎng)基平板固體發(fā)酵試驗(yàn)篩選，測定纖維素酶活，得到產(chǎn)酶量比T-F1突變菌株高2％以上的突變菌株--T-F2；

對(duì)上述獲得的F2菌株進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)、產(chǎn)酶量性質(zhì)分析，獲得一株產(chǎn)纖維素酶最高的突變菌株T-F22。

3.?如權(quán)利要求1所述的基因組重排木霉菌在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。

4.?根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因組重排木霉菌在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用，其發(fā)酵過程為：接種量為5％～15％濃度，水料比為1.0～3.0，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括1.5％～2％質(zhì)量濃度的碳源和1.5％～2％質(zhì)量濃度的氮源，發(fā)酵曲的初始pH值為4.5～7.0左右，發(fā)酵于26℃～31℃條件下進(jìn)行需氧發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵72h～84h。

5.?根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因組重排木霉菌在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用，其特征在于：碳源為2％秸稈、2％麩皮、1％秸稈+1％麩皮、1％秸稈+0.5％麩皮+0.5％CMC-Na；氮源為硫酸銨、硝酸銨、蛋白胨、脲、酵母膏。

6.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因組重排木霉菌在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用，其特征在于：碳源為1％秸稈+1％麩皮；氮源為硫酸銨。