[發明專利]聚乙二醇修飾的三價鐵亞血紅素短肽化合物及制備方法

無效

• 申請號: 200810050307.7
• 申請日: 2008-01-25
• 公開（公告）號: CN101220084A
• 公開（公告）日: 2008-07-16
• 發明（設計）人: 湯鈞;林航;李惟;王麗萍
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K1/107
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司
• 代理人: 張景林;劉喜生

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯衍生物修飾的亞血紅素短肽化合物及制備方法。

發明背景

亞血素六肽(Deuterohemin-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys，DhHP-6)是以微酶和天然抗壞血酸過氧化物酶結構為依據，設計的一種含亞血紅素的短肽，是一種較好的過氧化物酶模擬物。該短肽模擬酶分子量小于3000，可發展成高效的抗氧化藥物。但是，其生物利用率低，易受蛋白酶降解。

單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯的衍生物，是以聚乙二醇為主鏈，并具有一個甲氧基端基和一個活化的琥珀酰亞胺酯端基的高分子化合物。其中，聚乙二醇(PEG)是一種親水性、生物相容性的無毒聚合物，其通式為H(OCH₂CH)_nOH其中n≥4，其分子量為200至20000道爾頓不等。美國食品藥品管理局(FDA)已經批準了PEG作為輔料，在食品，化妝品，及靜脈注射，口服和經皮給藥等藥物產品中的應用。同時，其能通過肝腎途徑排出體外的特性，使其成為極為理想的藥用輔料。大量研究證明：單甲氧基化形式的PEG與蛋白質和/或肽化學偶聯后，能顯著延長后者的生物作用，許多PEG-蛋白和/或肽偶聯物能夠避免被蛋白酶酶解，而且/或者能使自身的免疫原性降低。PEG及其衍生物作為藥物制劑的載體已經在很多商業藥品中得到了廣泛的應用。

制備蛋白質和/或肽和聚乙二醇結合物的最常用的方法是利用PEG活化后形成的親電子基團和蛋白質/多肽上的氨基進行反應，反應后可以在一個蛋白/多肽分子上共價連接數個聚合物鏈，聚合物鏈的數目取決于蛋白質/多肽上可供結合的位點數、修飾劑的化學性質，修飾劑的過量比例及反應條件。

發明內容

本發明的目的在于將亞血紅素六肽(DhHP-6)用聚乙二醇(PEG)修飾，提供一種聚乙二醇修飾的三價鐵亞血紅素短肽化合物及制備方法。DhHP-6分子，有如下結構式(I)：

本專利采用的是目前廣泛應用且已商品化的活化聚乙二醇衍生物，聚乙二醇的結構式如下(II)：

本專利采用的活化聚乙二醇衍生物的結構通式如下(III)：

其中聚乙二醇(PEG)的重均分子量為2000-20000(相對應的，44≤n≤447)，k＝0～3，(聚乙二醇的分子量過小，其在體內的代謝產物可能對人體有害，太大不利于修飾，同時可能導致肽類藥物失活)；????

通過親核取代反應，制備一種聚乙二醇修飾的亞血紅素六肽，其結構通式如下(IV)：

R代表去除一個氨基(NH₂)的DhHP-6分子，具有如下結構(V)：

本發明描述的PEG修飾的DhHP-6的制備方法如下：

將DhHP-6溶于去離子水中配制成0.5～5mg/ml的溶液，向其中加入pH為5～8的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，稀釋至5～10倍體積，然后加入聚乙二醇衍生物或10～40mg/ml聚乙二醇衍生物的乙腈(ACN)溶液，反應溫度為0～25℃，反應中聚乙二醇衍生物與DhHP-6的摩爾比為5～20∶1，反應時間為0.5～4小時，反應結束后用甘氨酸終止反應，通過反相高效液相色譜接出PEG修飾的DhHP-6洗脫峰，在40℃下減壓下旋轉蒸發至無明顯氣泡產生，將殘液凍干，即可得PEG修飾的DhHP-6固體。

反相高效液相色譜柱的流動相為A：H₂O(含0.5％三氟乙酸(TFA，v/v))，B：90％的乙腈水溶液(含0.5％三氟乙酸(TFA，v/v))；濃度梯度為B相40％～60％，時間為40分鐘，(濃度由機器本身控制，初始狀態時，水與乙腈的體積比為6∶4，實驗過程中，機器在設定的時間內，這里是40分種內將自動升高乙腈相體積比并降低水相體積比，)，其中11分鐘左右出現的洗脫峰為DhHP-6峰，15分鐘左右出現的洗脫峰為PEG修飾的DhHP-6的峰。

制備反應如下式進行：

其中R-NH₂代表DhHP-6，聚乙二醇(PEG)的重均分子量為2000～20000(44≤n≤447)，k＝0～3，R代表去除一個氨基(NH₂)的DhHP-6分子；

前文所述的聚乙二醇衍生物是本領域技術人員所熟知的，包括：甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯等。

本發明的優點在于：

1.本發明所述的修飾方法簡便。反應在室溫下既可進行并且具有較高產率。