[發(fā)明專利]嗜熱脂肪酶基因、工程菌和嗜熱脂肪酶及應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810050250.0
• 申請日: 2008-01-14
• 公開（公告）號: CN101215571A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發(fā)明（設計）人: 馮雁;蔡錦剛;謝淵;宋搏
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/70;C12N9/20;C12N1/21;C12P7/64;C12R1/19
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司
• 代理人: 張景林;劉喜生

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種來源于超嗜熱細菌Fervidobacterium?changbaicum?CBS-1的嗜熱脂肪酶基因、由該基因重組載體在常溫宿主中表達的嗜熱脂肪工程菌，以及利用該工程菌構建的嗜熱脂肪酶及該嗜熱脂肪酶在工業(yè)中的應用。

背景技術

生物催化技術的深入研究與廣泛應用，是繼生物制藥和生物科技農(nóng)業(yè)之后，生物技術發(fā)展的“第三次浪潮”和重要支柱，這一技術的核心就是生物催化劑的開發(fā)。而酶作為生物催化劑已經(jīng)廣泛應用于化工、食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)等領域。但是工業(yè)生產(chǎn)所需的苛刻條件和酶穩(wěn)定性之間的矛盾，長久以一直在制約著酶技術的發(fā)展和應用。近些年來隨著人們對極端環(huán)境和微生物的深入研究，發(fā)現(xiàn)來源于超嗜熱微生物的嗜熱酶在高溫下顯示了良好的熱穩(wěn)定性和活性。因此，嗜熱酶的研究開發(fā)與應用可以很大程度的緩解現(xiàn)代工業(yè)中的苛刻反應條件和酶穩(wěn)定性之間的矛盾。嗜熱酶將在現(xiàn)代工業(yè)技術領域呈現(xiàn)巨大的應用潛力，將會大大推動生物技術產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。自1985年第一種嗜熱酶即TaqDNA聚合酶被成功地用于聚合酶鏈式反應(PCR)后，生長在特殊高熱環(huán)境下的微生物正日益引起人們的重視。在美國、日本、德國等地有20多個研究課題組正活躍于尋找嗜極菌及極端酶。近些年來，許多水解酶類的嗜熱酶相繼得到了開發(fā)，并在許多領域發(fā)揮了重要作用。嗜熱酶不僅具有化學催化劑無法比擬的優(yōu)點，如催化效率高和底物專一性強，而且酶的穩(wěn)定性極好。它可以克服中溫酶(mesophilic?enzyme，20-55℃)及低溫酶(psychrophilic?enzyme，-2-20℃)在應用過程中常常出現(xiàn)的生物學性質不穩(wěn)定的現(xiàn)象，從而使很多高溫化學反應得以實現(xiàn)，這將極大地促進生物技術產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，帶動技術水平和生活質量的提高。

利用嗜熱酶作為生物催化劑有如下優(yōu)點：(1)酶制劑的制備成本降低。因為嗜熱酶的穩(wěn)定性高，因而可以在室溫下分離提純和包裝運輸，并且能長久地保持活性；(2)加快動力學反應。隨著反應溫度的提高，分子運動速度加快，酶催化能力加強；(3)減少了能耗。因為在高溫情況下反應，因此對反應器冷卻系統(tǒng)的要求標準降低；(4)提高了產(chǎn)物的純度。在嗜熱酶催化反應條件下(超過70℃)，很少有雜菌生存，從而減少了細菌代謝物對最終產(chǎn)物的污染。由于嗜熱酶的高溫反應活性，以及對有機溶劑、去污劑和變性劑的較強抗性，使它在食品、醫(yī)藥、制革、石油開采及廢物處理等方面都有廣泛的應用潛力。

脂肪酶(lipase，E.C.3.1.1.3)全稱為三酰基甘油酯水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)，是指能在油水界面上水解脂肪的酶。脂肪酶催化三酰基甘油酯反應式：

因為脂肪酶在工農(nóng)及醫(yī)藥等很多方面有十分重要的作用，脂肪酶基因的研究引起人們的關注，迄今為止，人們已經(jīng)對多種脂肪酶的基因進行了克隆和研究。但不同菌屬細菌的脂肪酶基因差別很大。即使同一屬各種之間的同源性也很差。目前研究結果表明，脂肪酶是一種絲氨酸酶類，其發(fā)揮生物活性需要通過Ser，Asp和His或Ser，Glu和His組成的三聯(lián)體電子中繼網(wǎng)來完成。除此之外，有些種類的脂肪酶還需要一個額外的Ala的存在才能發(fā)揮高催化活性。雖然脂肪酶蛋白的氨基酸序列總體的同源性不高，但底物結合部位的氨基酸序列的同源性較高，絕大多數(shù)已知序列的脂肪酶蛋白均含有Gly-Xxx-Ser-Gly這樣一小段保守序列，而有的如枯草桿菌的脂肪酶含有Ala-Xxx-Ser-Xxx-Gly這樣一段序列。第一個Xxx為His或Gly，第二個Xxx為Met、Glu、Leu或是Ala。同時這五個氨基酸附近的十個氨基酸具有較高的同源性。

迄今為止，絕大多數(shù)脂肪酶都來源于常溫微生物或一般嗜熱微生物，很多脂肪酶盡管具有較好的催化活性，但是卻無法適應工業(yè)上較高溫度的反應體系，而來源于超嗜熱微生物的脂肪酶具有良好的熱穩(wěn)定性和高溫發(fā)揮催化活性的特性，因此，嗜熱脂肪酶的開發(fā)研究具有非常好的工業(yè)應用前景。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的之一是提供一種具有酯水解功能的嗜熱脂肪酶基因；

本發(fā)明的另一個目的是利用上述嗜熱脂肪酶基因通過生物工程技術構建一種嗜熱脂肪酶工程菌；