[發明專利]在昆蟲-桿狀病毒系統中表達IBV-HN99膜蛋白基因的方法

無效

• 申請號: 200810049558.3
• 申請日: 2008-04-15
• 公開（公告）號: CN101560522A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發明（設計）人: 賀秀媛;張淑霞;李玉峰;杜恩岐;崔沛;張君濤;張志平;崔保安;楊明凡;陳紅英;鄧立新;賀叢;董海聚;仝宗喜;張惠茹;白延杰;安森亞;朱翠娟;原維;李小波
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/50;C12N15/10;C07K14/165
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司
• 代理人: 張紹琳

技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種膜蛋白基因重組表達載體及在昆蟲-桿狀病毒系統中表達IBV-HN99膜蛋白基因的方法。

背景技術

雞傳染性支氣管炎(Infectious?Bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBronchitis?Virus，IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞的呼吸、消化和泌尿生殖系統，造成蛋雞產蛋數量減少，蛋的品質下降；雛雞由于呼吸道或腎臟感染而大批死亡。IBV的膜蛋白基因編碼M蛋白，M蛋白N端位于病毒粒子外部并被糖基化，其主要組成部分跨膜3次，M蛋白含有224～225個氨基酸殘基，分子質量為23ku，M蛋白橫跨囊膜，大部分在囊膜的內側面，僅有一小部分糖基化的N端露在膜外，其C端無明顯的親水區或疏水區。M蛋白的作用與病毒顆粒的形成有關。DAVID?F等在研究IBV糖蛋白結構與功能時發現糖基化的M蛋白與IBV的感染性有關，M蛋白由于糖基化程度不同，導致了M蛋白多態現象的產生(David?F?Stern，Bartholomew?M?Seffon.CoronavirusProteins：Structure?and?Function?of?the?Oligosaccharides?of?the?Avian?InfectiousBronchitis?Virus?Glycoproteins[J].Virology，1982，p：804-812.)。IBV?E蛋白和M蛋白的相互作用以及雙分子層的膜在VLP的形成和病毒出芽發揮著重要作用(Emily?Corse，Carolyn?E，Machamer.The?Cytoplasmic?Tail?of?Infectious?BronchitisVirus?E?Protein?Directs?Golgi?Targeting[J].Virology，2002，76：1273-1284.)。Ignjatovic研究發現S1、S2和M蛋白均可誘導細胞介導的免疫反應。同年，Ignjatovic?J，Galli?L在研究IBV結構蛋白免疫保護性時發現，M蛋白能夠誘導產生低滴度的限制性的交叉反應抗體，但M蛋白免疫的雞不能抵抗強毒的攻擊(Ignjatovic?J，Galli?L.Structural?proteins?of?avian?infectious?bronchitis?virus：role?inimmunity?and?protection[J].Adv?Exp?Med?Biol.)。在國內，陳萍等在2002年成功構建了重組質粒PC-M(IBVWHNJ)，分別采用裸露的質粒DNA疫苗和脂質體包被的M基因DNA疫苗免疫10日齡的雛雞，他們所制成的M基因DNA疫苗能誘導雞體產生體液免疫和細胞免疫，對強毒攻擊有一定的抵抗力，M基因DNA疫苗對雞的保護率可達70％。(陳萍.間接ELISA檢測IBV?DNA疫苗免疫抗體及IBV?M基因表達研究[A].2005年第二屆全國核酸疫苗與免疫研討會論文集[C].北京，2005：14.)

盡管如此，對M蛋白進行疫苗開發的報道相當少，現在的IBV?DNA疫苗的研究主要集中在免疫原性較高的N基因和S基因，對免疫原性較低的M基因的研究，國內外報道的都很少，因此，進一步研究M基因的免疫原性及其在IBV中的作用，對開發IBV?M基因的基因工程疫苗或M蛋白的ELISA診斷試劑盒具有重要的意義。

桿狀病毒表達系統自1983年建立以來，一直是應用最廣泛的真核表達系統之一，它雖然具有很多突出的優勢，但是也表現出一些不足。桿狀病毒表達系統在具體應用當中還有一個缺陷就是病毒感染昆蟲細胞后的病變及空斑難以識別，特別是對初學者。由于表達外源蛋白的需要，Bacmid缺失了多角體蛋白基因，使該系統就失去了天然的篩選標記，只能依靠病毒感染細胞后的病變來判斷。綠色熒光蛋白基因egfp是一個廣泛使用的報告基因，早期的研究表明，它能在昆蟲細胞中正常表達，并具有產生綠色熒光的能力，因此它也被應用到桿狀病毒表達系統中，但以前的研究多是預先將其構建到轉移載體中，再通過轉座與外源基因一起轉座到穿梭載體，從而指示病毒的侵染及蛋白質的表達，不能成為一個普通使用的系統。

發明內容

本發明的目的在于提供一種膜蛋白基因重組表達載體及其構建方法；本發明的另一目的在于提供一種在昆蟲-桿狀病毒系統中表達IBV-HN99膜蛋白基因的方法。

本發明目的是通過以下技術方案實現的：

一種膜蛋白基因重組表達載體，它同時含有麥芽糖標簽和綠色熒光蛋白基因，定名為Bacmid-egfp-MBP-M。