[發明專利]煙草復合病毒田間快速檢測試紙條及其制備方法

無效

• 申請號: 200810049514.0
• 申請日: 2008-04-09
• 公開（公告）號: CN101556282A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發明（設計）人: 邱立友;李富欣;王豹祥;劉欣;高玉千;戚元成
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/532;G01N33/558
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司
• 代理人: 張 春

1.一種煙草復合病毒田間快速檢測試紙條，其特征在于：該試紙條是在PVC 層(7)上設膠體金層析檢測試紙(1)，膠體金層析檢測試紙(1)的一端搭接 引水層(4)，另一端搭接吸水層(5)，膠體金抗體結合物玻璃纖維素紙(6)設 在引水層(4)下與膠體金層析檢測試紙(1)銜接，膠體金層析檢測試紙(1) 上設檢測線(2)和質控線(3)，檢測線(2)由兔多克隆抗體點樣形成的，質控線(3) 是由羊多克隆抗體點樣形成的；

其制備方法如下：

a.煙草復合病毒抗原的制備：

①分別取感染煙草花葉病毒、煙草黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的發病煙 草葉片，加兩倍體積內含0.1％的巰基乙醇的0.1mol/LPBSpH7.2，研碎，過濾；

②在步驟①所得濾液中加7-9％正丁醇，攪拌12-18min；

③取步驟②所得濾液10000g離心30min，棄沉淀，得上清液；

④將步驟③所得上清液中加入3-5％PEG、2-4％NaCl攪拌至溶解，4℃冰箱 內過夜；

⑤取步驟④所得溶液10000g離心12-18min，棄上清液；

⑥將步驟⑤所得沉淀物溶于0.01mol/L?PBSpH7.2緩沖液中，緩沖液加入量 是步驟④制得溶液每100ml加20ml的量，取10000g溶液離心12-18min，取上 清；

⑦將步驟⑥所得上清液按每10ml加入0.4g?NaCl及0.4g?PEG，隨加隨攪拌 至溶解，然后放置于4℃冰箱內過夜；

⑧取步驟⑦所得溶液10000g離心12-18min，棄上清液，按步驟⑦所得溶液 每100ml用2ml的量的0.01mol/L?PBS將沉淀物溶解；

⑨取步驟⑧所得溶液10000g離心12-18min，棄沉淀得上清液，上清液即為 粗提純病毒液，分別將粗提純的病毒液體保存在4℃冰箱內即可；

⑩蔗糖梯度是用0.1mol/L?PBSpH7.2緩沖液進行配制，配制成10％-40％的 蔗糖濃度梯度，按等量小心依次從高濃度到低濃度加入到離心管中，在4℃下放 置過夜，形成連續的密度梯度，將1.6ml病毒液加入梯度柱上，超速離心25000 rpm，1.5h，棄上清，離心后將上清液中形成的條帶從離心管中用注射器抽提出 來，使用透析袋進行脫糖，脫糖后超速離心40000rpm，1.5h，棄上清，用1ml 0.1mol/L?pH7.2PBS緩沖液溶解所得的沉淀物，即為精提純病毒液，作為純化 的煙草病毒抗原用；

b.兔多克隆抗體的制備：抗原注射量為0.1～0.2mg/kg，每次注射抗原用量 0.03～0.1mg，選用2～3Kg的兔子，采取靜脈注射方式注射，分三次完成，間隔 時間為10d，用無菌生理鹽水將抗原即純化的煙草普通花葉病(TMV)、黃瓜花葉 病(CMV)、馬鈴薯Y病毒病(PVY)稀釋為2mg/ml，第一次注射加等量的完全 Freund’s佐劑F5881，然混合均勻，注射便可，第二次注射是加等量的不完全佐 劑F5506，混合均勻注射，第三次注射步驟同第二次相同，末次注射10d后進行 放血，放血前動物禁食12h，采用耳靜脈放血40-60ml，收集后離心除去血細胞， 純化得兔多克隆抗體，將制得的兔多克隆抗體在-20℃保存，再將制得的煙草花 葉病毒、煙草黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的兔多克隆抗體按重量比1∶1∶1混合 得純化的煙草復合病毒抗體，將制得的煙草復合病毒抗體在-20℃保存；

c.羊多克隆抗體：從市場購買羊多克隆抗體；

d.膠體金的制備：取0.01％HAuCl₄?100ml，加入1％檸檬酸三鈉水溶液2ml， 加熱煮沸15-30min，直至顏色變紅，冷卻至常溫加入0.1M/L?K₂CO₃溶液0.2-1ml， 混勻即可，調pH至7.2-7.5，得膠體金溶液，然后用0.22μm濾膜進行過濾制得 20-30nm膠體金顆粒；

e.膠體金抗體結合物的制備：取步驟b制得的1mg純化的煙草復合病毒抗體， 邊攪拌邊注入到30-60ml步驟d制得的膠體金溶液中，15-30度下攪拌1h，然后加 入10％牛血清蛋白2-5ml，15-30度下攪拌5min，12000-15000rpm離心50min， 沉淀溶于4-10mlTBS緩沖液中，用0.45μm濾膜過濾即可得到膠體金抗體結合物， 4℃保存；

f.膠體金層析檢測試紙制備：將步驟e制得的膠體金抗體結合物3ml和3ml稀 釋液混勻，所述稀釋液成分及含量如下：Na₂HPO₄·12H₂O?6.1g，NaCl?8.5g，PVP40 5g，硼酸2.1g，PEG?1g，10％BSA?50mL，用6mol/L?HC1調pH至7.0～7.5，加水 至體積為1L；把玻璃纖維素紙放入混勻后的溶液中浸泡5-15min，取出在25-41℃ 烘箱中烤干，熱合封口，得膠體金抗體結合物玻璃纖維素紙，4℃保存備用；然 后將步驟b制得的煙草復合病毒兔多克隆抗體用PBS?PH7.4緩沖液稀釋成 3mg/ml，取1μl稀釋后的煙草復合病毒兔多克隆抗體點樣在NC膜上，即成檢測線， 將步驟c的煙草復合病毒羊多克隆抗體用固相溶液稀釋成1mg/ml，取1μl稀釋后的 煙草復合病毒羊多克隆抗體點樣在NC膜上，即成質控線，固相抗體NC膜在封閉 液中，所述封閉液是0.5％PVP，0.5％Triton?X-100，37℃下孵育1h后，在0.02mol/L PB?pH7.0的洗滌液中洗2次，室溫下風干即得膠體金層析檢測試紙，4-8℃保存；

g.煙草復合病毒田間快速檢測試紙條的制備：取一塊潔凈的PVC板，將步 驟f制得的膠體金層析檢測試紙固定在PVC板適當的位置上，將引水材料連接 在的膠體金層析檢測試紙下端即成吸水紙層，吸水材料連接在膠體金層析檢測 試紙的上端，膠體金抗體結合物玻璃纖維素膜置于引水材料下與膠體金層析檢 測試紙銜接，用切割機將組裝后的PVC板縱向切成5-7mm寬的測試條，將其 裝入板殼即樣品墊即可。