[發明專利]山茱萸核糖體DNA的ITS片段及其制備方法

無效

• 申請號: 200810049407.8
• 申請日: 2008-03-25
• 公開（公告）號: CN101285067A
• 公開（公告）日: 2008-10-15
• 發明（設計）人: 陳隨清;潘成學
• 申請（專利權）人: 河南中醫學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所
• 代理人: 聶孟民

一、技術領域

本發明涉及醫藥領域，特別是一種山茱萸核糖體DNA的ITS片段及其制備方法。

二、背景技術

山茱萸，又名山萸肉、萸肉、藥棗、棗皮等，是山茱萸科植物山茱萸Cornusofficinalis?Sieb.et?Zucc，除去果核的干燥成熟果肉，為我國名貴中藥材，具有補益肝腎，澀精固脫的功效，主治眩暈耳鳴，腰膝酸痛，陽痿遺精，遺尿尿頻，崩漏帶下，大汗虛脫，內熱消渴等癥，現代研究證明：山茱萸中含有多種成分，如有機酸類、環烯醚萜苷類、皂苷、鞣質類、多糖、氨基酸、維生素及礦物質等，具有較好的調節免疫系統功能、降血糖、抗炎、抗衰老等作用，因此，中醫臨床用量較大，同時作為常用中成藥(如六味地黃丸等)原料，中藥生產用量也很大。

山茱萸主產于我國的河南、浙江、陜西等省，四川、安徽、山東亦有栽培，但山茱萸在長期應用和栽培的過程中，種內產生很大變異，出現較多栽培品種，主要表現在這些品種的果實從形狀、大小、顏色、重量到產量、干果肉(藥材)得率，以及熊果酸、水溶性浸出物、脂溶性浸出物的含量等具有較大的差異，即它們的經濟價值和藥材質量是明顯不同的。國內學者根據山茱萸果實的不同形狀，對其進行了初步分類，分為：橢圓形果型、長梨形果型、短梨形果型、圓柱形果型、長圓柱形果型、短圓柱形果型和紡錘形果型。隨著近幾年來我國農村種植結構的調整，山茱萸的栽培面積正在逐漸擴大，由于山茱萸果樹良莠不齊，產量高低不一，品質差異較大，已嚴重影響了山茱萸的生產發展及臨床應用。

為此，國內外學者對山茱萸做了大量的研究工作，國外學者對山茱萸的基因序列做了一定的研究工作，但主要是基于山茱萸科不同種之間的比較。國內對山茱萸的研究主要集中對其化學成分及藥理作用的研究，并對各變異品種的品質進行綜合評價和分析，利用現代分子生物學技術對各品種進行RAPD分析，建立了山茱萸各品種RAPD指紋數據庫及遺傳關系樹系圖，分析各品種之間的遺傳關系。其中測定山茱萸核糖體DNA內轉錄間隔區ITS序列，制備出山茱萸核糖體DNA的ITS片段，為山茱萸的品種鑒定、品種改良、育種，以及種質資源的開發利用和保護可提供科學依據和物質條件，那么如何確定山茱萸核糖體DNA的ITS片段，并制備出山茱萸核糖體DNA的ITS片段呢？

三、發明內容

針對上述情況，本發明之目的，就是提供山茱萸核糖體DNA的ITS片段及其制備方法，可有效解決山茱萸的品種鑒定、品種改良、育種，以及種質資源的開發利用問題，根據分子生物學研究發現，生物類藥材所依賴的資源-“物種”的多樣性是由于其基因多態性的結果，最好是在DNA分子水平上進行，據此，本發明山茱萸核糖體DNA的ITS片段有三部分組成，即ITS1、5.8S、ITS2，其中，ITS1為253bp，5.8S為156bp，ITS2為273bp，總共682bp，該ITS片段的制備方法是：取山茱萸植物葉片研碎成細粉，將細粉置于提取緩沖液中，離心，棄去上清夜，再加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液以及β-巰基乙醇，混勻，加入由等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)制成的溶液處理2次，除去雜質，離心，取上清液，加入異丙醇，沉淀，收集沉淀物，抽干乙醇，得DNA物質，再利用設計的引物對DNA物質進行PCR擴增、純化，對純化后的PCR產物測序得ITS片段。本發明方法簡單、科學，為山茱萸的品種鑒定、品種改良、育種，以及種質資源的開發利用和保護提供了科學依據，有巨大的經濟和社會效益。

四、具體實施方式

根據上述技術方案，本發明在具體實施時，是由以下方式實現的。

本發明所說的山茱萸核糖體DNA(rDNA)的ITS片段是有三部分組成，即ITS1、5.8S、ITS2，其中，ITS1為253bp，5.8S為156bp，ITS2為273bp，總共682bp，具體是：

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