[發明專利]一種輔酶A的制備工藝

無效

• 申請號: 200810049249.6
• 申請日: 2008-02-20
• 公開（公告）號: CN101230374A
• 公開（公告）日: 2008-07-30
• 發明（設計）人: 李大平;崔鳳云;王金成;楊小棉
• 申請（專利權）人: 天津藥業焦作有限公司
• 主分類號: C12P19/40
• 分類號: C12P19/40;C12R1/15
• 代理公司: 鄭州科維專利代理有限公司
• 代理人: 張欣棠;張厚山

(一)技術領域

本發明涉及一種輔酶A的酶促合成反應工藝。

(二)背景技術

1954年，Hoagland提出了動物組織內輔酶A生物合成的途徑為：

Levintow也提出了相同的生物合成途徑。

1959年，Brown確定輔酶A生物合成的主要途徑為：

第一步是輔酶A生物合成中最重要的一步。

最初輔酶A主要從酵母細胞內提取分離得到，以后也經化學全合成制備，但兩方法都不理想，產率低或制造工藝復雜。而微生物發酵法生產輔酶A的開發利用，有望提供大量價廉的輔酶A以滿足需要。

輔酶A發酵始于1950年。Deveries等將弗氏鏈霉菌(Streptomyces?fradiae)于32℃培養88h，發酵單位很低，僅僅5u/ml。爾后的研究，特別是Ogata和Shimizu等發現幾乎所有微生物細胞內都有輔酶A合成酶系，而以兩株產氨短桿菌(Brevibacterium?ammoniagenes?IFO?12071和IFO?12072)的活性最強，發酵單位可達413u/ml。Shimizu等用產氨短桿菌詳細研究了輔酶A的發酵工藝。

文獻報導的輔酶A制備工藝路線：

1、以酵母為原料的提法

我國在采用新壓榨酵母發酵合成輔酶A也取得了一定成績，但在提取純化工藝上，沒有根本改變，資料介紹活力損失20～30％，按新鮮壓榨酵母計算，收率僅為3000單位/kg。另外，此純化工藝中采用鋅汞齊還原，此法不僅操作復雜，勞動強度大，收率低，而且影響生產工人的身體健康和造成環境污染。

2、以豬肝為原料的GMA提取法

此工藝收率低、純度差，資料介紹每kg肝中僅得輔酶A丙酮粉2×104單位，效價為120單位/mg，純度50％，且成品色澤較黃。

GMA-LD-601組合工藝總收率為30％。

3、產氨棒桿菌生物合成法

原來用酵母、白地霉等菌體細胞，經破壁提取輔酶A，因含量少，使產量受到一定的限制。1974年研究成功加入泛酸作前體，應用產氨短桿菌發酵合成輔酶A，并于1976年正式投入生產，成本比提取工藝下降4倍，質量由50單位/毫克提高到100單位/毫克以上。

(三)發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的一些缺陷，提供一種輔酶A制備方法。

通過微生物的三磷酸腺苷二鈉再生體系進行酶促合成輔酶A的制備工藝可分成兩大部分即發酵和提取純化。發酵部分包括微生物菌種選育、發酵條件和酶促反應條件。這一部分的關鍵涉及到使用菌種的選擇和酶促反應的條件。能進行酶促合成輔酶A的菌種有很多，如酵母菌、白地霉菌、短桿芽孢桿菌、假單孢菌、產氨棒桿菌等。從國內外的文獻報道來看，其中產氨棒桿菌通過發酵進行酶促合成輔酶A的產量是最高的，我們的工藝中采用的也是產氨棒桿菌。酶促反應的條件是指在微生物發酵到一定程度時加入輔酶A合成所需要的原料，即前體物質包括鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣、三磷酸腺苷二鈉等。

提取純化部分包括吸附、濃縮、分子篩層析、還原、沉淀。這部分工藝中的關鍵是分離純化柱的選用和還原反應，文獻上采用的是活性碳吸附柱吸附及陽柱、陰柱分離。

為了實現本發明的目的，本發明依據了下述的技術方案。一種輔酶A酶促合成反應工藝包括發酵部分和提取純化部分；

(1)發酵部分

所選用的輔酶A生產菌種經發酵培養，檢測PH值、OD值、殘糖并且鏡檢應無雜菌；

向酶反應液中分批次投入前體物質鹽酸半胱氨酸，泛酸鈣、三磷酸腺苷二鈉。

酶反應溫度控制在29℃～31℃之間進行，總體反應時間控制18～22小時，空氣流量控制為1∶0.5，攪拌，得到反應液；

反應液酸化、壓濾，得到壓濾清液。

(2)提取純化部分

步驟(1)所得的壓濾清液選用DA210-B型非極性大孔樹脂進行吸附分離，洗脫得到分離液，

分離液中加入用L-半胱氨酸為絡合劑、投入亞銅離子反應形成巰醇鹽，分別用稀酸和純化水洗滌、脫銅后得濃縮液；

采用G-25型葡聚糖凝膠樹脂對脫銅后的濃縮液進行分離純化，利用核酸蛋白檢測儀280nm波長檢測，收集輔酶A和有效成分；

濃縮液再用飽和的強堿，如氫氧化鉀、氫氧化鈉或氫氧化鋰溶液調節PH值至4.5～5.0，優選氫氧化鋰溶液調節PH值。以巰基乙醇為還原劑，溫度控制在34～36℃，時間控制在10～14小時；