[發明專利]離體培養和秋水仙素處理結合選育多倍體毛泡桐的方法

有效

• 申請號: 200810048497.9
• 申請日: 2008-07-24
• 公開（公告）號: CN101322474A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發明（設計）人: 蔡得田;唐志強;陳冬玲;宋兆建;何玉池
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: A01H1/08
• 分類號: A01H1/08;A01H4/00;A01H5/12;A01H5/02;A01G31/00;C12Q1/68;C12N5/04
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所
• 代理人: 丁齊旭

1.一種以胎座為外植體的離體培養和秋水仙素處理結合選育多倍體毛泡桐的方法，其特征在于過程為：

a.選擇親本

以優良的無叢枝病已開花的毛泡桐植株為取材的親本；

b.以胎座為最佳外植體

以開花后30～35天果實中的胎座為最佳外植體進行組織培養；

c.胎座愈傷組織誘導

采取開花后30～35天無胚珠的胎座在MS+2，4-D0.5-2.0mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3％+agar0.75％的培養基中，25℃±1℃黑暗條件下培養30～35天，誘導形成愈傷組織；

d.胎座愈傷組織加倍處理

將旺盛生長、淺黃色較松散的愈傷組織轉到MS+2，4-D0.5-2.0mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3％+秋水仙素0.05％-0.075％的液體培養基中，置于105～110rpm的恒溫搖床上在22～25℃旋轉培養48～72hr；

e.處理后愈傷組織恢復培養

無菌取出處理后的愈傷組織，經無菌水沖洗3次后接種于MS+2，4-D0.5-2.0mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3％+agar0.75％的培養基中，25℃±1℃黑暗條件下恢復培養7～10天，處理后淺黃褐色愈傷組織生長出淺黃色愈傷組織；

f.愈傷組織分化培養

將恢復后的愈傷組織轉到MS+NAA0.3-0.5mg/l+6BA2.0-3.0mg/l+sucrose2％+agar0.75％的培養基中，光強1500～2000Lux、12hr/d，25℃±1℃分化培養，直至分化出芽苗；

g.芽苗生根培養

待芽苗生長到3.0～6.0cm高，具有3.5～7.0片葉時，將它們分株轉移至2/3MS+IBA0.5-1.0mg/l+NAA0.1-0.5mg/l+活性炭0.03％-0.05％+sucrose2％+agar0.75％的培養基中，光強1500～2000Lux、12hr/d，25℃±1℃條件下生根培養，10～35天后芽苗陸續分化出根；

h.組培苗的移栽

當生根的組培苗具有7.0～10.0片葉，株高5.0～10.0cm時，放置在散射光下煉苗1～2天，然后洗凈組培苗根部的培養基，移栽到已滅菌的裝有2/3細砂+1/3園土為基質的泥缽中，噴水罩薄膜，保持相對濕度90％左右，上蓋遮陽網，連續3天后，逐漸揭開薄膜，適時噴水保濕，在移栽后的第3天、第7天、第15天分別噴施1/10MS大量元素促進試管苗的成活，移栽15天后揭去遮陽網，30天后將小苗移至田間；

i.毛泡桐植株多倍性的形態學鑒定

多倍體毛泡桐的葉片為卵圓形、葉片邊緣有小鋸齒狀缺刻，二倍體毛泡桐的葉片為五角形、葉片全緣；多倍體毛泡桐的葉片下表皮的氣孔密度比二倍體小，氣孔長寬比二倍體大，氣孔保衛細胞中的葉綠體數比二倍體毛泡桐多近一倍；

j.毛泡桐植株多倍性的染色體數鑒定

四倍體毛泡桐的根尖染色體數是2n＝80，二倍體毛泡桐的根尖染色體數是2n＝40；

k.毛泡桐植株多倍性的流式細胞儀分析鑒定

將葉片制取細胞核懸浮液后，經含有RNase的碘化丙啶染色處理和溫育30min后，置于流式細胞儀下分析，四倍體毛泡桐的DNA熒光值在213.0～228.0，是二倍體毛泡桐114.0的近2倍；

l.開花期毛泡桐植株多倍性鑒定

取開花期毛泡桐的花朵，測定花朵長度、花萼寬度、花絲長度、花藥寬度、花柱長及子房長度和直徑，四倍體毛泡桐的花器明顯比二倍體毛泡桐的大，其中四倍體毛泡桐的花絲長度、花藥寬度、子房長度和直徑的值接近二倍體毛泡桐的2倍；四倍體毛泡桐的結實率為0，二倍體毛泡桐的結實率為27.5％～62.3％。