[發(fā)明專利]一種快速檢測空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變點的熒光定量PCR方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810048093.X
• 申請日: 2008-06-19
• 公開（公告）號: CN101348831A
• 公開（公告）日: 2009-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁宗輝;郝海紅;戴夢紅;王玉蓮;黃玲利;彭大鵬;王旭;陳冬梅;陶燕飛;魏亞靜;郭文韜
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所
• 代理人: 王敏鋒

1.一種快速檢測空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥突變點的熒光定量PCR方法，其特征在于利用特異性TaqMan探針，同時檢測空腸彎曲桿菌23S?rDNA中的2074位和2075位的基因突變，它包括下述步驟：

a、根據(jù)空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯耐藥突變位點的靶基因序列設(shè)計、合成引物和熒光探針；

b、將引物、熒光探針與反應(yīng)試劑配比、組合，構(gòu)成實時熒光定量PCR反應(yīng)體系；

c、優(yōu)化實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件，其中退火溫度為58℃至64℃；

d、進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，鑒別人工構(gòu)建的野生型和突變型對照質(zhì)粒；

e、進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，鑒別空腸彎曲桿菌耐藥相關(guān)基因的突變情況；

其中：步驟a中所述的空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯耐藥性突變位點的靶基因序列位于一對引物之間，序列長度為147bp，該基因的核苷酸序列如下：

CGAGATGGGAGCTGTCTCAAAGAGGGATCCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTC

CTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAGCTTGACACTGCT

ACTTGGATAAGAATGTGCAGGATAGGTGGG；

步驟a中所述的引物對的核苷酸序列如下：

引物1：5’CGA?GAT?GGG?AGC?TGT?CTC?AAA?G?3’，

引物2：5’CCC?ACC?TAT?CCT?GCA?CAT?TCT?T?3’；

步驟a中所述的熒光探針為TaqMan探針，其探針5’端為FAM或HEX熒光基團標記，3’端標記熒光淬滅集團TAMRA，所述的熒光探針的序列為：

探針WT：(FAM)-TCCACGGGGTCTTTCCGTCTTG-(TAMRA)，

探針A2074C：(HEX)-TCCACGGGGTCTTGCCGTCTT-(TAMRA)，

探針A2075G：(HEX)-TCCACGGGGTCTCTCCGTCTTG-(TAMRA)。

2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b所述熒光定量PCR反應(yīng)體系中的引物與探針的體積比為10∶1～10∶6；還包括在整個反應(yīng)體系中添加1～2％體積的二甲亞砜。

3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中所述的熒光定量PCR反應(yīng)條件為：94℃/95℃10秒～5分鐘1循環(huán)；94℃/95℃5～10秒、58～64℃20秒，共計30～50個循環(huán)。?