[發(fā)明專(zhuān)利]適宜機(jī)械化收獲的矮桿緊湊型油菜的育種設(shè)計(jì)及鑒定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810048092.5
• 申請(qǐng)日: 2008-06-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101292626A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 傅廷棟;涂金星;馬朝芝;沈金雄;易斌;文靜;李新華;漆麗萍;楊軍;劉志文
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): A01H1/04
• 分類(lèi)號(hào): A01H1/04;A01H1/02;A01H1/08;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所
• 代理人: 王敏鋒

1、選育適應(yīng)于高密度種植和機(jī)械化收獲的矮桿緊湊型油菜的方法，其步驟如下：

(1)以保藏編號(hào)為CCTCC-P200601的甘藍(lán)型油菜品種5148-2為母本，以加拿黃籽油菜DH系品種YN90-1016為父本進(jìn)行雜交，得到雜種F₁；

(2)于油菜開(kāi)花期取雜種F₁植株主花序和上部分枝花序上大小為2.8-3.8mm的幼蕾提取小孢子，以50mg/L的秋水仙堿加倍染色體48小時(shí)，通過(guò)小孢子培養(yǎng)獲得雙單倍體(DH)分離群體；

(3)對(duì)步驟(2)的分離群體進(jìn)行三年、每年兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)田間表型特征鑒定，選擇株高、分枝特性、花序長(zhǎng)度、角果數(shù)量、生育期五個(gè)主選性狀與普通油菜存在差異的表型為矮桿、株型緊湊、分枝及主花序短小簇生、花期集中和結(jié)英層緊密的油菜變異類(lèi)型材料，得到矮桿緊湊型油菜品種；

(4)利用分子標(biāo)記方法對(duì)步驟(3)的矮桿緊湊型油菜品種進(jìn)一步鑒定。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述的分子標(biāo)記鑒定步驟如下：

(1)選取待測(cè)品種及對(duì)照為矮桿緊湊型油菜的植物幼嫩葉片，用SDS法提取葉片總DNA，采用苯酚-氯仿-異戊醇法純化總DNA以進(jìn)行PCR鑒定；

(2)以步驟(1)中提取的待測(cè)品種DNA為模版，按照下列反應(yīng)體系進(jìn)行SSR擴(kuò)增：25ng·μl^-1樣本總DNA?2μl，10mmol·L^-1dNTPs?0.2μl，10×擴(kuò)增緩沖液1μl，5U?Taq酶0.1μl，25mmol·L^-1Mg²⁺0.8μl，50ng·μl^-1引物(上下游引物混合液)0.5μl，ddH₂O?5.4μl，總體積10μl。PCR熱循環(huán)程序?yàn)椋?/p>

95℃2min；1個(gè)循環(huán)；

94℃1min；60℃30s，每循環(huán)降0.5℃；72℃45s；10個(gè)循環(huán)；

94℃1min；55℃30s；72℃45s；36個(gè)循環(huán)；

72℃10min，1個(gè)循環(huán)；

常溫保存；

(3)擴(kuò)增產(chǎn)物加入等體積的變性上樣緩沖液，95℃變性3min后立即冰浴冷卻，然后在預(yù)先制好的丙烯酰胺變性凝膠板上加樣，再在1500V穩(wěn)壓條件下電泳40～60min后終止電泳；

(4)小心剝下膠板，經(jīng)過(guò)冰醋酸固定、ddH₂O漂洗、硝酸銀溶液染色、ddH₂O漂洗、無(wú)水碳酸鈉溶液顯影、冰乙酸停影、ddH₂O漂洗等過(guò)程，將分離的DNA指紋用于鑒定；

(5)比較待測(cè)品種SSR擴(kuò)增帶型與矮桿緊湊型油菜的帶型的差異；

用于矮桿緊湊型油菜SSR鑒定的引物如下：

上游引物5’TTG?AAG?TAG?TTG?GAG?TAA?TTG?GAG?G?3’

下游引物5’CAG?CAG?CCA?CAA?CCT?TAC?G?3’；

上游引物5’TGG?ATG?AAA?GCA?TCA?ACG?AG?3’

下游引物5’ATC?AAT?CAA?CAC?AAG?CTG?CG?3’；

上游引物5’GTG?TGC?AGG?AAA?CGA?TGT?TC?3’

下游引物5’GGG?AGT?TTG?AAG?AGA?AAG?CG?3’；

上游引物5’CTT?TGT?GGT?GGG?TAG?TGG?3’

下游引物5’ACT?TAG?CCT?CAA?TAC?GGT?CTT?3’；

上游引物5’AAT?TTA?AAC?CTC?ATT?TTC?TTC?3’

下游引物5’ACC?TCC?ATT?GTG?TCT?GAT?3’；

上游引物5’ACG?GTG?CCG?AAT?CTC?AAC?G?3’

下游引物5’AAA?TGG?GTC?ACA?GCC?GAG?AA?3’；

上游引物5’CCC?GTC?AAC?CAA?ATC?ACA?3’

下游引物5’CGC?AAG?GTT?GTT?ATC?TAA?TC?3’；

上游引物5’TCT?CAA?AAG?GAT?ATG?CGT?GAA?3’

下游引物5’CAA?AAC?TCA?TCA?GGG?TTG?TAG?3’；

上游引物5’AAG?CGC?GCA?TAA?CTA?CAC?3’

下游引物5’AAC?ACT?GCT?CCT?TTC?CCT?3’。