[發(fā)明專利]一種用于篩選定向進(jìn)化突變酶的快速質(zhì)粒營救法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810047900.6
• 申請(qǐng)日: 2008-06-03
• 公開（公告）號(hào): CN101302559A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬向東;柯濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/25
• 分類號(hào): C12Q1/25;C12Q1/02;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢金堂專利事務(wù)所
• 代理人: 丁齊旭

1、一種用于篩選定向進(jìn)化突變酶的快速質(zhì)粒營救法，其特征在于步驟為：

A、將定點(diǎn)誘變和隨機(jī)誘變的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌；

B、構(gòu)建目的基因的巨大突變文庫；

C、高溫60-100℃處理(10-30分鐘)構(gòu)建的突變基因文庫；

或者酸堿pH4～10處理(10-15分鐘)后，再高溫60-100℃處理(10-30分鐘)構(gòu)建的突變基因文庫；

D、直接挑選在高溫條件下有酶活的轉(zhuǎn)化子的部分死亡菌體；

E、將挑出的少量死亡的菌體和大腸桿菌的高效感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行混合，采用快速轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化；

F、最后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定直到獲得目的突變子。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于篩選定向進(jìn)化突變酶的快速質(zhì)粒營救法，其特征在于步驟為：

1.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：將定點(diǎn)誘變和隨機(jī)誘變的不同大小重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-GOLD，涂布帶有氨芐抗性的LB平板Amp50u/ml，37℃培養(yǎng)過夜，到轉(zhuǎn)化子單菌落直徑大小約為1～2mm，選取質(zhì)粒，構(gòu)建突變體文庫；

2.將突變體文庫分別置于60～100℃，加熱處理10～30min；或者用pH為4.0～10.0的緩沖液分別對(duì)文庫平板處理10～15min后，再高溫60-100℃處理(10-30分鐘)；

3.營救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化從加熱處理后的培養(yǎng)基上隨機(jī)選擇3個(gè)克隆，用牙簽或小槍頭刮下菌體，在冰浴條件下，分別混勻于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞液中，進(jìn)行快速轉(zhuǎn)化，然后分別將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布于含Amp50u/ml的LB培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)；

4.細(xì)菌質(zhì)粒的提取驗(yàn)證：挑取轉(zhuǎn)化克隆，接種于1ml含Amp50u/ml的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過夜，按試劑盒說明抽提細(xì)菌質(zhì)粒，然后用0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒分子量。