[發明專利]一種檢測漢坦病毒基因組的RT－PCR法

無效

• 申請號: 200810047356.5
• 申請日: 2008-04-17
• 公開（公告）號: CN101294226A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發明（設計）人: 楊占秋;李晴;陳文;劉婧;肖紅;付萍
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及到病毒檢測領域，具體涉及一種檢測漢坦病毒(HV)基因組的方法，包括設計了兩對新型漢坦病毒通用引物，研究了實驗條件，建立了病毒基因組的RT-PCR方法，并對不同年代漢坦病毒血清標本進行了檢測。

背景技術

病毒性疾病是一類嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，85％以上的傳染性疾病由病毒引起，重要病毒危害到國家安全和社會發展。漢坦病毒(Hantaviruses，HV)是腎綜合征出血熱(hemorrhagic?fever?with?renal?syndromes，HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(hantavirus?pulmonary?syndrome，HPS)的病原體，人可通過氣溶膠吸入、傷口、消化道等途徑感染，被世界衛生組織列為可通過氣溶膠傳播的生物武器。HFRS/HPS的主要特征是發熱、出血腎損害和呼吸衰竭。我國是受漢坦病毒危害最為嚴重的國家，HFRS患者占世界的90％以上。HFRS是經嚙齒類動物傳播的急性自然疫源性疾病。HFRS疫區已擴大到全國31個省市，同時疫區類型亦發生改變，80年代前為漢灘型(HTN型)疫區，之后又出現漢城型(SEO型)且兩型并存，2003年又報道有普馬拉型(PUU型)出現。HV是分節段的負單鏈RNA病毒，由L、M、S三個片段組成，分別編碼RNA聚合酶、外膜糖蛋白(G蛋白，GP1&GP2)和衣殼核蛋白。

常規的診斷檢測方法包括病毒的分離鑒定、ELISA法檢測血清中抗HV?IgM、IgG抗體，IFA法檢測病毒抗原和抗體，核酸分子雜交檢測病毒基因組等。但經典的分離鑒定法費時，IFA法也不適用于快速的現場檢測，檢測HV抗體僅是一個側面的間接指標，用PCR法檢測組織和細胞中HV?RNA已有報道，并認為這一方法直觀優越，但陽性率低，檢測保存時間久的血清中病毒RNA的研究也未見報道。為了提高血清中HV的檢出率和準確性，本發明設計了兩對新引物，建立了一種檢測血清中病毒RNA的新方法，用于不同時期血清標本的檢測，并得到了優勢株病毒基因組。國內外尚未見此新型漢坦病毒通用引物的研究報道。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種檢測漢坦病毒基因組的方法，涉及到所提供RT-PCR的方法在檢測血清樣本中HV基因組的應用。該法直觀優越、敏感性好、特異性高，對檢測微量、保存時間久的標本中漢坦病毒基因組的效果良好，可用于漢坦病毒感染的實驗室檢測和HRFS/HPS的分子流行病學調查。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

A、設計兩對新型漢坦病毒通用引物

本發明中所設計的兩對新型漢坦病毒通用引物，從GenBank中獲得HTV76-118、HTV?84Fli、HTV?CUMC、HTV?HoJo、HTV?HV114、HTV?Lee、HTV?NC167、SEO?Biken-1、SEO?HR80-39、SEO?KI-83-262、SEO?KI-85-1、SEO?KI-88-15、SEOL99、SEO?R22、SEO?SR-11共15株漢坦病毒基因編碼氨基酸序列和cDNA序列。將所有氨基酸序列和cDNA序列輸入DNASTAR?MegAlign軟件用Clustal?W程序排列，尋找氨基酸序列及對應cDNA序列均保守區域作為引物設計區(見表1)。國內外尚未見此新型漢坦病毒通用引物設計的研究報道。

????????????????表1漢坦病毒引物設計

B、漢坦病毒基因組檢測的方法

a、用病毒特異性RNA提取試劑盒(Promega公司病毒基因組RNA?Kit)提取標本血清總RNA；

b、核酸分析儀檢測RNA含量，所有標本RNA?OD260/280≥1.9，后取50ngRNA進行RT-PCR反應；

c、RT-PCR：RT使用HV屬特異性引物P₀(5’-ATGCAATATGATGAAAAG-3’)，其反應條件為37℃反應60min，93℃5min終止反應，迅速置冰上冷卻3min；PCR使用技術方案A中設計的新型HV通用引物(P₁/P₂，P₃/P₄)，其反應條件為94℃預變性3min，94℃變性1min，50℃復性1min，72℃延伸1min，循環35次，最后72℃延伸5min；

d、1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察病毒核酸擴增結果，在250bp處出現一條特異性核酸帶。