[發明專利]GSNO還原酶活力定量檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200810047088.7
• 申請日: 2008-03-18
• 公開（公告）號: CN101245369A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 曹毅;楊旭;吳凱;丁書茂;袁均林
• 申請（專利權）人: 華中師范大學
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司
• 代理人: 張安國

技術領域

本發明涉及一種GSNO還原酶活力檢測用的試劑盒，適用于與GSNO還原酶和一氧化氮信號通路相關疾病的病因及發病機理的基礎研究，適用于各種環境或化學因素引起的GSNO還原酶活力水平變化的定量檢測。

背景技術

亞硝基硫醇(S-nitrosothiol，SNO)是一氧化氮與硫醇類化合物形成的酯，在一氧化氮信號通路中起重要作用。GSNO還原酶是一種SNO的代謝酶，可調控機體SNO濃度水平，并在SNO相關疾病中起重要作用。因此，研究GSNO酶活力的誘導在SNO相關信號通路中有重要意義，并有可能成為SNO相關疾病中的關鍵事件。

目前國內外主要根據NADH的氧化反應來測定GSNO還原酶活力，該方法靈敏度高，簡單方便。但由于需要稱取和配制的試劑較多而使用非常不方便，且會因為實驗人員及儀器準確性等原因造成較大系統誤差。目前國內外尚無用于GSNO還原酶活力檢測的試劑盒。

發明內容

本發明的任務是優化NADH氧化法測定GSNO還原酶活力，并提供一套預先由生產廠家稱量配制和分裝好，臨時用只需簡單操作即能使用的試劑盒。提供靈敏、簡便、不需要昂貴試劑盒設備的GSNO還原酶活力檢測方法，并且樣品處理簡單，可廣泛用于生理病理條件下GSNO還原酶活力測定。

本發明的技術方案是：

將生物樣品分為兩份，一份加入含GSNO的Tris-HCl?NADH溶液，一份加入不含GSNO的Tris-HCl?NADH溶液，37℃水浴充分反應5min后，使用磺基水楊酸終止反應，于340nm下檢測，并通過NADH的摩爾吸光系數計算NADH的變化量，計算得出GSNO還原酶活力。

本發明的結構為：一種GSNO還原酶活力的定量檢測試劑盒，包括盒體、盒蓋和固定板，盒體內放置著試劑瓶1，4、5，以及EP管2和3，五個試劑瓶由固定板分隔固定，每個試劑瓶上有說明標簽，試劑瓶內封閉包裝著固定重量比配合標準稱量的試劑，試劑瓶1中裝有pH8.0的20mM?Tris-HCl?0.5mM?EDTA溶液，EP管2中裝有NADH溶液，EP管3中裝有GSH和NaNO₂固體，試劑瓶4中裝有HCl-EDTA溶液，試劑瓶5中裝有磺基水楊酸EDTA溶液，EP管3外有黑色塑料袋包裝，試劑瓶1，4和5均為白塑料瓶。

本GSNO還原酶活力定量檢測試劑盒的盒體和盒蓋用硬紙或薄塑料板制作，固定板用塑料泡沫板制作。

使用本發明時，操作者按照試劑盒說明書操作使用，就可以測定各類細胞樣品GSNO還原酶活力水平。本發明簡化了實驗操作中的很多繁雜步驟，能節約實驗者時間，較好地滿足實驗操作的簡單化和提高實驗結果的準確性。

附圖說明：

圖1：GSNO還原酶活力定量檢測試劑盒結構圖

圖中序號標示：1、4和5為試劑瓶，2和3為1.5mL?EP管，6為固定板，7為盒體，8為盒蓋。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明的構成與使用方法，作進一步的詳細說明：

檢測試劑盒的構成：

試劑瓶1：白色塑料瓶，瓶內封閉包裝pH8.0的20mM?Tris-HCl?0.5mM?EDTA溶液。準確稱取1.576g?Tris-HCl，0.093g?EDTA，充分溶解于500mL雙蒸餾水中，使用NaOH調節pH為8.0，此為試劑I。

EP管2：普通EP管，管內封閉包裝含0.01526g?NADH，此為試劑II。

EP管3：黑色塑料袋包裝EP管，管內封閉包裝0.0614g?GSH和0.0138g?NaOH，保持管內干燥，此為試劑III。

試劑瓶4：白色塑料瓶，瓶內封閉包裝0.5M?HCl?EDTA溶液。準確稱取0.0093gEDTA，溶解于50mL?0.5M?HCl中，此為試劑IV。

試劑瓶5：白色塑料瓶，瓶內封閉包裝5％磺基水楊酸EDTA溶液，準確稱取0.0186g?EDTA，5g磺基水楊酸，溶于100mL雙蒸餾水中，得到0.1M?NaNO₂標準溶液，此為試劑V。

上述三個試劑瓶和兩個EP管一同放入一個由硬紙材料制成的長方形盒子7中，并用帶有圓孔的塑料泡沫板7固定各試劑瓶，然后用盒蓋8蓋好加封。

本檢測試劑盒的使用方法，檢測步驟：

1.將試劑II加入1mL試劑I，振蕩使試劑溶解，此為NADH溶液。