[發明專利]分析浮游生物群落DNA多態性的方法

無效

• 申請號: 200810046697.0
• 申請日: 2008-01-16
• 公開（公告）號: CN101215606A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 余育和;顏慶云;馮偉松
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

1.一種分析浮游生物群落DNA多態性的方法，其步驟是：

A、樣品采集：

用有機玻璃采水器分別采集等體積的表、底層水混合，水樣混勻后用GF/C濾膜過濾0.2-0.5L水樣；

B、浮游生物群落DNA提取：

將過濾后的GF/C濾膜在無菌的條件下剪碎，并浸沒于裝有3mL裂解緩沖液的離心管中，裂解緩沖液成分為0.5％SDS，10mM?Tris-Cl，100mM?EDTA及0.1mg/mL蛋白酶K；55℃水浴裂解10h，10000r/min離心5min后將上清轉入一新的離心管，再次離心取上清經等體積的酚→酚∶氯仿(1∶1)→氯仿三次抽提后用預冷的無水乙醇于-20℃沉淀3h，13000r/min離心10min后去上清并用70％的乙醇清洗3次，每次清洗完于13000r/min離心10min、棄上清，干燥后加入20-50μL?TE溶解，DNA存于-20℃備用；

C、隨機擴增多態性DNA分析：

首先對PCR反應體系中的DNA、Mg²⁺、dNTP、Taq酶及引物濃度和循環參數進行優化，其次是從2-5組隨機引物篩選出擴增結果穩定、譜帶清晰、多態性好的7-10條隨機引物對浮游生物群落DNA進行PCR擴增；在25μL體系中包含50-100ng?DNA，1×Buffer，2mM?Mg²⁺，80μM?dNTP，0.8μM?10個堿基長度的隨機引物，1.5U?Taq酶，混勻后離心將反應液集中于管底進行以下擴增：94℃預變性5min，后接45個循環，最后于72℃延伸5min，反應終止于4℃，PCR產物用1.4％-2.0％的瓊脂糖凝膠進行電泳分離、UVP成像分析系統拍照；

D、浮游生物群落核糖體RNA基因的PCR擴增及變性梯度凝膠電泳分析：

分別采用針對16S?rDNA的引物和18S?rDNA的引物對浮游生物群落DNA進行PCR擴增，50μL體系中含有40-100ng?DNA，1×PCRBuffer，2mM?Mg²⁺，80μMdNTP，3.0U?Taq酶，正、反向引物各0.3μM，反應物混勻后離心將反應液集中于管底進行如下擴增：94℃變性5min后進行遞減PCR，每個循環94℃變性30s，低溫退火30s，72℃延伸60s，最后于72℃延伸10min，反應終止于4℃，通過1.4％-2.0％瓊脂糖凝膠電泳確認目的片段并確定后續變性梯度凝膠電泳的上樣量，等量的PCR產物用9％的丙稀酰胺通過INGENYphorU-2系統進行變性梯度凝膠電泳，變性劑梯度范圍為40％-60％，60℃恒定溫度以50-60mA的恒定電流電泳12-16h，經1×SYBR?Gold染色后用UVP成像分析系統拍照；

擴增16S?rDNA的引物：

正向引物P1：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；

反向引物P2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

擴增18S?rDNA的引物：

正向引物P3：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3’；

反向引物P4：5’-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG-3’；

E、利用Quantity?One軟件對圖譜進行定性、定量分析：

RAPD/DGGE指紋圖譜通過凝膠專業分析軟件Quantity?One進行定性和定量分析，進而對不同時空樣品浮游生物群落DNA多態性進行對比分析，獲得不同環境條件浮游生物群落DNA指紋結構的相似性矩陣。