[發明專利]一種在Ti－O薄膜表面固定層粘連蛋白的方法

無效

• 申請號: 200810046047.6
• 申請日: 2008-09-12
• 公開（公告）號: CN101357240A
• 公開（公告）日: 2009-02-04
• 發明（設計）人: 陳俊英;黃楠;葛勝男;冷永祥;楊蘋;王進;孫鴻;萬國江;趙安莎;游天雪;吳熹
• 申請（專利權）人: 西南交通大學;成都交大麥迪克科技有限公司
• 主分類號: A61L27/40
• 分類號: A61L27/40;A61L27/06;A61L27/34;A61L31/12;A61L31/02;A61L31/10
• 代理公司: 成都博通專利事務所
• 代理人: 陳樹明

所屬技術領域

本發明涉及無機材料表面改性技術，特別涉及人工器官材料Ti-O薄膜表面的生物化改性方法。

背景技術

鈦基金屬已被廣泛應用于生物醫學領域，而其表面自然形成的Ti-O薄層被認為是鈦具有良好生物相容性的主要原因。但是，就臨床應用而言，鈦基金屬的生物相容性遠未滿足臨床需要。

在生物材料表面進行生物大分子固定已經成為提高其表面生物相容性的最優方法之一，另外，在材料表面引入細胞膜受體所能識別的生物特異性蛋白，將促進受體-配體作用，改善生物相容性。層粘連蛋白(Ln)是胚胎發育中出現最早的細胞外基質成分，因此材料表面固定Ln生物分子可促進細胞的粘附和生長。但層粘連蛋白的長久穩定固定通常要求材料表面具有可與其發生反應的活性基團，如：羥基(-OH)、氨基(-NH2)、羧基(-COOH)；而Ti-O薄膜為無機材料，無法直接與生物分子發生作用而將其固定。目前也無將層粘連蛋白固定到Ti-O薄膜的文獻報道。

發明內容

本發明的目的就在于提供一種在Ti-O薄膜表面固定層粘連蛋白的方法，用該種方法可在Ti-O薄膜表面牢固固定層粘連蛋白，Ti-O薄膜具有良好的血液相容性和內皮細胞相容性。

本發明實現以上發明的目的采用的技術方案是，一種在Ti-O薄膜表面固定層粘連蛋白的方法，其步驟為：

A、Ti-O薄膜清洗將Ti-O薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸餾水進行超聲波清洗，獲得潔凈的薄膜表面，干燥；

B、強堿活化在50-80℃振蕩條件下，將潔凈的Ti-O薄膜放入濃度為8-12％WT的NaOH溶液中浸泡1-5小時，然后用雙蒸水沖洗，再干燥；

C、強酸活化將98％(WT)H₂SO₄與30％(WT)H₂O₂按體積比1∶0.5-3配制混合液，在60-95℃下，將B步獲得的Ti-O薄膜用該混合液浸泡1-4小時，然后用雙蒸水沖洗，再干燥；

D、偶聯配制1-3％wt?r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作為偶聯劑溶液，在50-70℃下，將C步獲得的Ti-O薄膜浸泡到該偶聯劑溶液中24-72小時，然后回流漂洗2-6小時，之后在蒸餾水中超聲清洗，從而在Ti-O薄膜表面形成偶聯劑單層，然后干燥；

E、生物分子固定配制20-60mg/L濃度的層粘連蛋白溶液，滴入5-15mL/L的水溶性碳二亞胺(EDC)催化劑，并用0.22μm慮膜過濾；在無菌條件下，將D步獲得的Ti-O薄膜浸泡入該蛋白溶液，并于37±0.5℃恒溫孵化箱靜置6-24小時，使層粘連蛋白固定到Ti-O薄膜表面，最后在磷酸鹽緩沖液中振蕩漂洗，常溫晾干，即得。

參見說明書附圖1，本發明的反應過程與機理是，通過強堿與強酸及H₂O₂溶液浸泡，在Ti-O薄膜表面獲得羥基，然后通過r-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇偶聯劑溶液浸泡，使Ti-O薄膜表面的羥基與偶聯劑的乙氧基團反應，而在Ti-O薄膜表面形成偶聯劑單層，最后，通過在加有水溶性碳二亞胺(EDC)催化劑的層粘連蛋白溶液中浸泡，使偶聯劑的氨基與層粘連蛋白的羧基發生反應，從而在Ti-O薄膜表面固定上層粘連蛋白單層。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

一、創造性的選擇出活化方式、偶聯劑和生物分子，從而借助特別的表面活化-偶聯-生物分子固定的方法，先將Ti-O薄膜表面活化形成羥基，再通過羥基構建一層偶聯劑中間層，該中間層與Ti-O薄膜和生物分子層均能形成化學鍵合。這樣，一方面使層粘連蛋白在Ti-O薄膜表面的固定均勻牢固，另一方面使得Ti-O薄膜具有優異的生物相容性。試驗也證明，用同樣方法固定纖粘連蛋白，其血小板粘附數量增加，血液相容性差，而本發明方法在Ti-O薄膜表面固定層粘連蛋白后同時具有良好的血液相容性和內皮細胞相容性，即生物相容性好。

二、由于整個過程均采用浸泡方式進行，因此可以實現工業上具有復雜體型結構的生物醫用裝置如人工心臟瓣膜、血管支架、血栓濾器等表面層粘連蛋白生物化修飾，其適用范圍廣。

三、由于整個過程操作簡單，無需特殊昂貴的設備，其制作成本低。

附圖說明

下面結合附圖和實施例對本發明的方法作進一步詳細的說明。

圖1為本發明方法各步驟在Ti-O薄膜表面所對應產生的共價接枝過程的示意圖。

圖2a為未固定層粘連蛋白的Ti-O薄膜表面粘附的血小板的掃描電鏡圖。