[發明專利]結核病抗原特異的全血IFN-γ診斷試劑盒及其制作方法和應用方法

無效

• 申請號: 200810045220.0
• 申請日: 2008-01-21
• 公開（公告）號: CN101493454A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 范雄林
• 申請（專利權）人: 范雄林
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1、本發明涉及結核病和結核分枝桿菌感染者的診斷試劑盒及在結核病和結核桿菌感染者的早期、快速和特異性診斷的應用方法。

2、根據權利要求1所述的建立診斷試劑盒，其原理是利用結核桿菌特異的抗原，刺激受檢者的外周血并產生IFN-γ，按照市售的雙抗原夾心法人IFN-γELISA檢測說明，檢測IFN-γ的濃度。因為結核病病人和結核分枝桿菌感染者可產生高水平的IFN-γ，達到對結核病和結核分枝桿菌感染者的診斷目的。

3、根據權利要求2所述建立的診斷試劑盒，其組成的特征在于包括以下組份：

(1)根據權利要求4所述的結核桿菌的特異重組蛋白；

(2)雙抗原夾心法人IFN-γELISA檢測試劑kit(市售)

4、根據權利要求3所述的一種結核桿菌特異重組蛋白，其特征在于組成該特異重組蛋白的成份包括結核分枝桿菌抗原Rv3875和Rv3874，其核苷酸的序列特征為SEQ.ID.NO.1，氨基酸序列特征為SEQ.ID.NO.6。

5、如權利要求4所述的抗原，用于機體的細胞免疫應答檢測，至少包含以下兩種以上的T細胞表位，這些表位在SEQ.ID.NO.6中的位置和特征如下：P.1-16：MTEQQWNFAGIEAAAS；P.9-24：AGIEAAASAIQGNVTS；P.17-32：AIQGNVTSIHSLLDEG；P.57-72：KWDATATELNNALQNL；P.80-95：GQAMASTEGNVTGMFA；P111-129：MAEMKTDAATLAQEAGNF；P123-137：QEAGNFERISGDLKTQ；P165-182：VVRFQEAANKQKQELDEI；P185-202：NIRQAGVQYSRADEEQQQ；P195-210：RADEEQQQALSSQMGF。

6、如權利要求4所述的抗原Rv3875和Rv3874來源的細菌菌種，僅限于結核分枝桿菌的不同型別(人型和牛型)及由這些型別衍生的細菌菌株，以實現結核桿菌特異抗原的目的。

7、如權利要求4所述的結核桿菌特異重組蛋白的構建表達和純化方法，其特征在于具體步驟如下：首先重組蛋白編碼基因通過PCR技術從權利要求3所述的細菌DNA中擴增獲得；其次將重組蛋白的編碼基因，克隆構建在原核表達質粒中，并將上述質粒轉化工程宿主菌大腸桿菌；最后進一步從表達該蛋白的大腸桿菌工程菌中分離純化該蛋白。

8、如權利要求4所述建立該重組蛋白的工程菌的PCR擴增引物序列包括SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5。

9、根據權利要求1所述的結核病抗原特異的全血IFN-γ診斷試劑盒的應用方法，其特征在于該應用方法包括以下兩大階段：一是抗原特異的IFN-γ釋放階段：包括采集的樣本為受檢者的外周靜脈血；用權利要求4所述的特異重組蛋白刺激外周血細胞，37度培養箱靜止培養20-24h；收集培養上清中的血漿。二是抗原特異的IFN-γ檢測階段：按照市售的雙抗原夾心法人IFN-γELISA檢測試劑kit中的說明，檢測上述血漿中IFN-γ的含量。