[發明專利]一種結核桿菌特異的重組蛋白的表達純化方法及其應用

無效

• 申請號: 200810045219.8
• 申請日: 2008-01-21
• 公開（公告）號: CN101492497A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 范雄林
• 申請（專利權）人: 范雄林
• 主分類號: C07K14/35
• 分類號: C07K14/35;C12N15/31;C12N15/70;C12N15/11;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1、本發明涉及一種結核桿菌特異重組蛋白，其特征在于組成該特異重組蛋白的成份包括結核分枝桿菌抗原CFP21(Rv1984c)和MPT64(Rv1980c)。以及用CFP21-MPT64重組蛋白建立全血IFN-γ釋放分析檢測試劑盒，并建立相應的應用方法。

2、根據權利要求1所述的結核桿菌特異重組蛋白，建立全血IFN-γ釋放分析診斷試劑盒，其原理是利用結核桿菌特異的抗原，刺激受檢者的外周血細胞并產生IFN-γ，按照市售的雙抗原夾心法人IFN-γELISA檢測說明，檢測IFN-γ的濃度。因為結核病病人和結核分枝桿菌感染者可產生高水平的抗原特異的IFN-γ，實現對結核病和結核桿菌感染者的早期、快速和特異性診斷的目的。

3、如權利要求1所述的抗原CFP21和MPT64來源的細菌菌種，包括結核分枝桿菌的不同型別(人型和牛型)及由這些型別衍生的細菌菌株，實現結核桿菌特異抗原的特征。

4、如權利要求1所述一種結核桿菌特異重組蛋白，其核苷酸的序列特征為SEQ.ID.NO.1，氨基酸序列特征為SEQ.ID.NO.6。

5、如權利要求1所述的結核桿菌特異重組蛋白的構建表達和純化方法，其特征在于具體步驟如下：首先重組蛋白編碼基因通過PCR技術從權利要求3所述的細菌DNA中擴增獲得；其次將重組蛋白的編碼基因，克隆構建在原核表達質粒中，并將上述質粒轉化的工程宿主菌種是大腸桿菌；最后進一步從表達該蛋白的大腸桿菌工程菌中分離純化該蛋白。

6、如權利要求6所述的PCR擴增引物序列包括SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5。

7、根據權利要求1所述的結核病抗原特異的全血IFN-γ診斷試劑盒的應用方法，其特征在于該應用方法包括以下兩大階段：一是抗原特異的IFN-γ釋放階段：包括采集的樣本為受檢者的外周靜脈血；用權利要求所述1的特異重組蛋白刺激受檢者的外周血細胞，37度培養箱靜止培養20-24h；最后收集培養上清中的血漿。二是抗原特異的IFN-γ檢測階段：按照市售的雙抗原夾心法人IFN-γ?ELISA檢測試劑kit中的說明，檢測上述血漿中IFN-γ的含量。