[發明專利]一種農桿菌介導的菘藍轉基因方法

無效

• 申請號: 200810045072.2
• 申請日: 2008-03-27
• 公開（公告）號: CN101280319A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發明（設計）人: 王躍華;何俊蓉;孫雁霞;鄔曉勇;徐文俊;張海強
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H1/00;A01H5/06
• 代理公司: 成都科奧專利事務所
• 代理人: 王蔚

技術領域

本發明涉及一種農桿菌介導的植物轉基因方法，特別是涉及一種農桿菌介導的菘藍轉基因方法。

背景技術

十字花科(Cruciferae)植物菘藍(Isatis?indigotica?Fort)是我國南北各地廣泛種植的一種大宗中草藥，其根和葉是常用中藥板藍根和大青葉的主要來源。板藍根在臨床上用途較廣，除板藍板注射液外，主要常與其它中藥組成復方廣泛用于治療多種疾病如流感、腮腺炎、乙腦、肝炎，是公認的有較好抗病毒效果的中藥之一，此外，還具有抗炎、免疫調節、抗菌、解熱、緩痛等藥理作用。

80年代開始利用根瘤菌科(Rhizobiaceae)農桿菌屬(Agrobacterium)的發根農桿菌(Agrobacterium?rhizogenes)侵染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物，甚至是裸子植物而誘發植物產生毛狀根。發根農桿菌中含有致使植物產生毛狀根的Ri質粒，在Vir區基因產物協助下，Ri質粒中的T-DNA片段能轉移進植物核基因組中，導致轉化成功的植物產生大量的毛狀根。毛狀根具有生長速度快，不需要添加外源激素，并能提供大量可藥用的次生代謝產物的特征。農桿菌Ri質粒上攜帶的生根基因不僅能使被感染植物部位產生大量的毛狀根，而且由產生的毛狀根還可以獲得再生的轉化植株，這些植株可表現出許多穩定遺傳的表現變異，在植物品種的改良方面具有較廣闊的應用前景。

目前已有農桿菌介導的植物轉基因方法申請了專利，如申請號為200510037948.5的“一種楊樹的農桿菌基因轉化方法”等，這些方法目前存在如下問題：一是都包含有共培養步驟，因此轉化步驟多，花費時間長，轉化成本高；二是外植體除菌是通過在增殖培養基或/和篩選培養基中加入抗生素來實現的，因而只能去除與培養基相接觸的表面上的細菌，其它未與培養基接觸的表面上的細菌則不能去除，因此除菌效果不佳，存活率低；三是轉化率較低。

本發明的目的是提供一種轉化率高、轉化成本低、除菌效果好的農桿菌介導的菘藍轉基因方法，該方法取消了共培養步驟。

為達到上述目的，本發明采用的解決方案包括如下步驟：

將農桿菌劃線接種于YEB固體培養基上培養1～2天后，用牙簽挑取生長好的單菌落于YEB液體培養基中震蕩培養；

將菘藍種子先用無菌水浸泡，再用消洗靈浸泡，然后用無菌水沖洗2～4次，再用1‰的升汞消毒，并在消毒后用無菌水沖洗2～4次，最后用無菌濾紙吸干水分，接種于MS固體培養基中，在光照條件下進行培養；

將上述獲得的菘藍無菌苗切成約1～2cm長的外植體，接種于MS固體培養基中預培養12～48小時，然后放入上述制得的農桿菌菌液中，在超聲波的輔助下振蕩浸泡，使外植體與農桿菌充分接觸，取出外植體，用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，轉入篩選培養基中誘導毛狀根，當篩選培養基上出現農桿菌菌斑時，取出外植體先用無菌水沖洗2～4次，再用含有抗生素的脫菌水除菌，然后用無菌濾紙吸干水后，接入新配制的篩選培養基上繼續誘導培養，直至產生毛狀根；

將上述獲得的毛狀根接入液體增殖培養基中培養，產生大量的毛狀根。

上述菘藍種子先用無菌水浸泡2～6小時后，再用0.02％的消洗靈浸泡2～6min，1‰的升汞消毒1～2次，每次3～5min。

所采用的農桿菌為發根農桿菌ATCC15834或Ri1601，培養溫度為25～30℃，所培養的農桿菌菌液OD₆₀₀＝0.3～0.8。

上述菘藍外植體在農桿菌菌液中浸泡8～15min，其中用超聲波輔助超聲作用為1～3min。

上述篩選培養基是1/2MS+頭孢噻肟鈉200～500mg/L+瓊脂6～8g/L+蔗糖15～25g/L，誘導毛狀根的培養溫度為25～30℃，光照強度為1500～2000Lx，每天光照8～16小時。

上述脫菌水為含200～500mg/L頭孢噻肟鈉的抗菌素水，用脫菌水除菌的時間為3～10min。

上述MS固體培養基為MS+瓊脂6～8g/L+蔗糖20～30g/L，培養溫度為25～28℃，光照強度為1500～2000Lx，每天光照8～16小時。

本方案中毛狀根最好采用液體培養基進行增殖培養，所選擇的液體增殖培養基為1/2MS+頭孢噻肟鈉200～500mg/L+蔗糖15～25g/L。

本發明具有如下效果：