[發明專利]一種喜樹多倍體的誘導方法

無效

• 申請號: 200810044988.6
• 申請日: 2008-03-14
• 公開（公告）號: CN101243773A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 王躍華;孫雁霞;張海強;徐作英;鄔曉勇;劉碧崇
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: A01H1/08
• 分類號: A01H1/08;A01H4/00;A01G31/00;G01N33/48;C12N5/04
• 代理公司: 成都科奧專利事務所
• 代理人: 王蔚

技術領域

本發明涉及一種喜樹多倍體的誘導方法。?

背景技術

喜樹屬珙桐科旱蓮屬植物，是中國特有的經濟樹種，1998年8月被批準為第一批國家重點II級保護野生植物。喜樹中含有的喜樹堿具有顯著的抗腫瘤活性和獨特的抗癌機制。研究證實，喜樹堿通過抑制DNA拓撲異構酶I的活性及逆轉錄病毒的復制來阻止細胞DNA、RNA的合成，是迄今為止發現的唯一專門通過抑制拓撲異構酶I發揮細胞毒性的天然植物活性成分。前期臨床試驗表明，喜樹堿及其衍生物對膀胱癌、腦癌、乳癌、宮頸癌、結腸癌、白血病、肺癌、淋巴癌和肝癌等30余種腫瘤都有不同程度的療效，從而引起人們的廣泛關注，使喜樹成為繼紅豆杉之后又一重要的木本抗癌藥用植物。喜樹堿是存在于喜樹的樹皮、根、果實和葉中的具有五元環的生物堿，由于喜樹堿是喜樹的次生代謝物，因而在喜樹中的含量非常低，用常規的從喜樹中提取喜樹堿的方法會造成喜樹植物資源的極大破壞，當采集量超過植物的再生能力時，必然會導致喜樹物種的瀕危甚至滅絕。隨著人們對喜樹堿類抗癌藥物需求的不斷增加，單純靠從喜樹中提取喜樹堿的方法已遠遠不能滿足市場的需求。?

發明內容

本發明的目的在于針對現有喜樹中喜樹堿含量低的問題，依據植物細胞染色體加倍后，染色體上基因調控有效化學成分的含量往往較正常二倍體高，同時多倍體植物還具有器官巨大性的特征而提供一種喜樹多倍體的?誘導方法，該方法可以培育出有效成分(即喜樹堿)含量高的喜樹四倍體組培苗，從而滿足人們對喜樹堿類抗癌藥物日益增長的需要。?

為達到上述目的，本發明采用的解決方案是：選取喜樹的莖或葉作為外植體，并進行消毒處理，將消毒后的外植體接種于愈傷組織培養基中進行培養，再將培養后的愈傷組織置于濃度為100mg/L～500mg/L的秋水仙堿溶液中浸泡12～48小時，然后用無菌水進行沖洗，再轉移到不含秋水仙堿的芽分化培養基上暗培養7天后，轉入光照培養，待不定芽生長50天后，對其進行多倍體鑒定，選取具有四倍體特征的不定芽轉入增殖培養基中產生四倍體叢生芽，再將生長2cm以上的叢生芽分割為單株，轉入壯苗培養基中進行培養，然后選擇生長健壯的無根苗接種于生根培養基中，培養出喜樹四倍體組培苗，當組培苗長至3cm以上時，打開瓶蓋，在室內煉苗3～5天，移栽到滅過菌的珍珠巖—田土的基質上；?

所述愈傷組織培養基為：B₅+NAA0～1mg/L+2，4-D0.5～2mg/L+KT0.5mg/L；?

所述芽分化培養基為：MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.2mg/L；?

所述增殖培養基為：MS+NAA0.1～0.5mg/L+6-BA1.0mg/L；?

所述壯苗培養基為：MS+NAA0.05mg/L+6-BA0.3mg/L；?

所述生根培養基為：1/2MS+NAA0.1～0.3mg/L+IBA1.0mg/L；?

上述所有培養基的配制PH均為5.6～6.5，瓊脂均為0.7～0.8％，其中愈傷組織培養基、芽分化培養基、增殖培養基和壯苗培養基中蔗糖含量為30g/L，生根培養基中蔗糖含量為15g/L；所有培養基的培養條件為：溫度23～27℃、每天光照12小時、光照強度1500～2000Lx。?

上述方案中外植體消毒所采用的消毒液為濃度是70％-75％的酒精和濃度是0.1％的升汞。?

上述方案中多倍體是這樣鑒定的：取生長50天后的不定芽于濃度為0.2％的秋水仙素溶液中預處理2.3～2.7小時后，用水沖洗，然后用按3∶1體積比配制的甲醇—冰醋酸固定液固定3.5～4.5小時，接著用纖維素酶和果膠酶各占2.5％的混合酶在25℃恒溫箱內處理2.8～3.2小時，倒去酶液，用蒸餾水沖洗2～3次，每次2分鐘，去除蒸餾水，制備細胞懸液，并用懸滴法制片，干燥后用改良苯酚品紅染色后觀察，如染色體數目均為2n＝4x＝88，則確定為四倍體不定芽。?

上述方案中珍珠巖—田土的基質中珍珠巖與田土的配比為3∶7，組培苗移栽至珍珠巖—田土的基質后，應適當遮光，并保持相對濕度在75～85％。?

本發明由于以細胞分裂旺盛的愈傷組織細胞為處理材料進行喜樹植物的多倍體誘導，因此獲得同源多倍體植株的效率高；又因為喜樹多倍體植株的有效成分含量高，因此培育出的喜樹具有的喜樹堿含量就高，從而可滿足人們對喜樹堿類抗癌藥物的需求。該發明對于喜樹植物的改良遺傳及保護我國喜樹資源具有重要的作用。?

具體實施方式

實施例1?