[發明專利]一種蠶豆根尖細胞微核制片方法

無效

• 申請號: 200810044985.2
• 申請日: 2008-03-14
• 公開（公告）號: CN101246098A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 王躍華;孫艷;鄭奕;孫雁霞;馬丹煒;徐文俊;鄔曉勇;劉碧崇
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 成都科奧專利事務所
• 代理人: 王蔚

技術領域

本發明涉及一種細胞微核制片方法，特別是涉及一種蠶豆根尖細胞微核制片方法。

背景技術

植物蠶豆(Vicia?faba?L)根尖細胞的染色體大，數量少，DNA含量多，對誘變劑反應敏感。蠶豆根尖細胞微核技術是1982年由Francesca和MaTe-Hsiu建立的，目前已在環境污染監測和致突變劑檢測方面被中國、美國、聯合國環境規劃署(UNEPA)和世界衛生組織(WHO)等眾多的國家、地區及國際組織認可。中國國家環境保護總局2002年頒布的《水和廢水監測分析方法》中，將蠶豆根尖微核試驗列為在環境監測與執法過程中使用的B類方法，并在蠶豆根尖微核試驗中提供了具體的席夫試染色制片方法，該方法的步驟是：取約1厘米根尖→加卡諾氏固定液固定24小時→用蒸餾水浸洗兩次，每次5分鐘→吸凈蒸餾水→加入5摩爾/升鹽酸，放入28℃水浴鍋中水解25分鐘→用蒸餾水洗兩次，每次5分鐘→用席夫試液遮光染色12分鐘→用SO₂洗滌液浸洗兩次，每次5分鐘→用蒸餾水浸洗5分鐘→用解剖針截下1毫米長的根尖→滴上少許45％的乙酸溶液→用解剖針搗碎根尖→壓片→觀察。這種微核制片方法的步驟多，試驗耗時長，藥品花費量大，并且由于席夫試染液的配制、使用過程中都需要遮光，給試驗增加了一定的難度；另外由于蠶豆根尖細胞用濃鹽配進行離析的時間很難掌握，在試驗過程中常造成根尖細胞時而離析不夠，細胞不能壓成單層；時而離析過度，又影響細胞的著色；以及用席夫試染蠶豆根尖細胞時間較長，其試劑中含有的鹽酸往往使材料過于軟化，也影響到細胞核的著色情況，從而直接造成蠶豆根尖細胞微核制片的質量不佳。

我們知道，細胞微核制片方法是確保細胞微核制片質量的關鍵，直接影響到蠶豆根尖微核技術監測環境污染的可行性和準確性。從當前使用的制片方法來看，確實存在上述不足，因此在一定程度上限制了我國蠶豆根尖細胞微核技術在環境污染監測和致突變劑檢測方面的廣泛運用。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足而提供一種試驗步驟少、試驗時間短、藥品耗費少、細胞微核制片質量佳的蠶豆根尖細胞微核制片方法。

為達到上述目的，本發明采用的解決方案是：先將蠶豆種子進行催種催芽，然而切取約1cm長度的根尖，放入配制的固定離析液中處理4～6分鐘，再將處理后的根尖取出，用蒸餾水清洗干凈后進行染色壓片，所述固定離析液由固定液和離析液按1∶1的比例(體積比)現用現配，其中固定液由無水乙醇和冰醋酸按125∶3的比例(體積比)配制，離析液選用濃鹽酸，染液為Giemsa染液或改良苯酚品紅染液，染色時間為4～7分鐘。

上述方案中根尖在固定離析液中進行處理時的溫度為27～29℃。

本發明與現有席夫試染色制片方法相比具有如下優點：(1)由于將固定、離析融合為一步完成，因此實驗步驟大大簡化，試驗時間明顯縮短，由原來的需要25小時左右才能完成的試驗，縮短為僅需30分鐘左右就可完成，藥品耗費也明顯減少。(2)由于采用的是Giemsa染液或改良苯酸品紅染液，因此操作簡便，無需遮光；并且細胞核著色穩定，細胞核、質著色對比度大，細胞輪廊清晰，能清楚地辨別出微核所屬的細胞，因而可準確地計算出監測細胞中的微核數，使微核制片效果達到較佳，從而確保了用蠶豆根尖微核技術監測環境浸染的可行性和準確性。該方法可廣泛應用到對各種水源、大氣、土壤、農藥以及食品、食品添加劑、藥品、化妝品和放射性污染等的質量檢測中。

下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。

具體實施方式

實施例1

(1)浸種催芽：選擇無病蟲害的蠶豆種子用25℃溫水浸泡，待種子吸脹后，剝去胚根附近的種皮，放入鋪有一層濾紙的培養皿中，加入少量蒸餾水，在30℃恒溫培養箱中進行催芽培養，在培養期間要勤換水，待根長到1～2cm時，選出根生長良好、長度一致的種子進行試驗；

(2)配制固定離析液：先按125∶3的體積比取無水乙醇和冰醋酸，并將其混合制成固定液，離析液選用濃鹽酸，再按1∶1的體積比將固定液和離析液混合配制成固定離析液；

(3)固定離析：取長約1cm的根尖放入28℃固定離析液中處理5min，隨即取出根尖用蒸餾水清洗2～3次，每次2～3min，直至將根尖上的固定離析液清洗干凈；

(4)染色壓片：將洗凈后的根尖置于載玻片上，吸干水分，用解剖針取根尖1mm左右，并用解剖針仔細搗碎，然后在根尖細胞上滴加Giemsa染液染色6min后，蓋上蓋玻片進行壓片并在顯微鏡下觀察。根據試驗觀察，用Giemsa染液染色，微核制片效果最好。

實施例2